Nrf2對(duì)缺氧預(yù)處理內(nèi)皮祖細(xì)胞成血管作用的影響及相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　動(dòng)脈粥樣硬化所致的缺血性疾病(包括缺血性心臟病、缺血性腦卒中和外周動(dòng)脈疾病等）嚴(yán)重危害中老年人的健康。盡管藥物治療和介入治療取得了巨大進(jìn)展，但對(duì)于急性心肌梗死和冠心病三支血管病變不適合冠脈介入治療患者，促進(jìn)缺血心肌血管生成，改善心肌供血，對(duì)于緩解臨床癥狀、提高心功能和改善預(yù)后具有重要意義。內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)是血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，具有血管生成的先天優(yōu)勢(shì)，因此，通過促進(jìn)EPCs血管生成和改善組織供血而被廣泛用于細(xì)胞

2、移植治療缺血性心臟病和外周動(dòng)脈粥樣硬化性疾病的研究。然而，由于這些組織多存在嚴(yán)重的缺血缺氧的微環(huán)境，不利于細(xì)胞生存和發(fā)揮作用，致使大部分移植細(xì)胞發(fā)生凋亡或死亡。因此，如何調(diào)節(jié)和促進(jìn)移植的EPCs在缺血組織的生存具有重要研究意義。
　　核因子相關(guān)因子-2(Nrf2)是機(jī)體抗氧化反應(yīng)的重要因子，其激活后可以誘導(dǎo)下游多種抗氧化基因和Ⅱ相解毒酶基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，從而發(fā)揮抗氧化應(yīng)激的保護(hù)作用。基礎(chǔ)研究表明，缺血缺氧組織中存在嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)和

3、氧化應(yīng)激反應(yīng)，這是促使移植細(xì)胞發(fā)生凋亡和壞死的最重要因素。而Nrf2是否涉及移植細(xì)胞在缺血缺氧微環(huán)境的生存調(diào)節(jié)及其具體機(jī)制尚不清楚。缺氧預(yù)處理可以增強(qiáng)多種細(xì)胞移植治療的療效和功能，Nrf2是否涉及這一過程以及機(jī)制如何，亦不清楚。因此，本研究擬應(yīng)用密度梯度離心加貼壁培養(yǎng)法獲得骨髓源EPCs，運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)使該EPCs過表達(dá)Nrf2或降低Nrf2表達(dá)，再給予不同缺氧條件下預(yù)處理，通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)觀察不同缺氧條件下EPCs的生物學(xué)特性改變、

4、血管生成能力及其與Nrf2的關(guān)系，探討分析Nrf2對(duì)缺氧預(yù)處理后EPCs的細(xì)胞生存、在血管生成中的作用的影響及其機(jī)制。
　　方法：
　　1.內(nèi)皮祖細(xì)胞培養(yǎng)及其生物學(xué)特性
　　通過密度梯度離心加貼壁培養(yǎng)法從大鼠骨髓獲得骨髓源EPCs，通過培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)、細(xì)胞內(nèi)吞試驗(yàn)和流式細(xì)胞儀鑒定細(xì)胞表面抗原標(biāo)記三個(gè)方法鑒定培養(yǎng)細(xì)胞為EPCs。
　　2.Nrf2在缺氧預(yù)處理的EPCs中的表達(dá)及促血管生成作用與機(jī)制研究
　　

5、將EPCs分為四組:1）對(duì)照組;2）EPCs-Nrf2-siRNA組;3）EPCs-Con-siRNA組;4) EPCs-Nrf2組。根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌?，給予相應(yīng)缺氧預(yù)處理，并進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn):1)應(yīng)用熒光探針DCFH-DA試劑盒檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平;2）采用AnnexinⅤ/PI雙染色后行流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平;3）應(yīng)用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力;4）應(yīng)用細(xì)胞劃痕試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力;5）應(yīng)用ELISA法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)基中HIF-1α和VE

6、GF水平，評(píng)價(jià)細(xì)胞旁分泌功能;6）應(yīng)用激光共聚焦檢測(cè)缺氧誘導(dǎo)的Nrf2核轉(zhuǎn)位情況;7）應(yīng)用熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR和Western Blot檢測(cè)缺氧誘導(dǎo)的信號(hào)通路激活情況以及Nrf2與其下游靶基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)情況。
　　3.Nrf2在EPCs血管生成中的作用及機(jī)制
　　體外實(shí)驗(yàn):應(yīng)用Tube Formation試驗(yàn)觀察缺氧誘導(dǎo)的上述四組細(xì)胞血管生成能力;體內(nèi)實(shí)驗(yàn):建立心肌梗死大鼠模型，并根據(jù)移植細(xì)胞不同，即EPCs、EPC

7、s-Nrf2-siRNA、EPCs-Con-siRNA和EPCs-Nrf2，相應(yīng)分為四組:1）對(duì)照組;2）EPCs-Nrf2-siRNA組;3) EPCs-Con-siRNA組;4）EPCs-Nrf2組。細(xì)胞移植采用心肌梗死交界區(qū)直接注射細(xì)胞方法。應(yīng)用免疫熒光染色觀察不同移植細(xì)胞組28d時(shí)細(xì)胞存活和局部細(xì)胞凋亡情況;應(yīng)用CD31免疫組化染色觀察局部血管生成情況。
　　結(jié)果：
　　1)密度梯度離心加貼壁培養(yǎng)法可以獲得較大數(shù)量和

8、高純度的EPCs。
　　2)應(yīng)用細(xì)胞內(nèi)吞試驗(yàn)和流式細(xì)胞儀鑒定細(xì)胞表面抗原標(biāo)記CD34、CD133、KDR和CD31，證明培養(yǎng)細(xì)胞為目的細(xì)胞EPCs。
　　3)缺氧誘導(dǎo)EPCs產(chǎn)生ROS，并激活Nrf2核內(nèi)轉(zhuǎn)位。
　　4)siRNA干擾Nrf2后加重缺氧誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并抑制細(xì)胞增殖能力，并降低細(xì)胞遷移能力;而高表達(dá)Nrf2抑制缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)細(xì)胞遷移能力，但對(duì)細(xì)胞增殖能力無影響，這些結(jié)果表明，Nrf2有利于維持缺

9、氧微環(huán)境中的細(xì)胞生存。同時(shí)，Nrf2正性調(diào)節(jié)缺氧誘導(dǎo)的EPCs旁分泌功能。
　　5)缺氧通過激活細(xì)胞PI3K/Akt信號(hào)途徑而促進(jìn)Nrf2表達(dá)增加，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞中HO-1和NQO1 mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)。
　　6)缺氧誘導(dǎo)EPCs形成膠管樣結(jié)構(gòu);siRNA干擾Nrf2顯著降低缺氧誘導(dǎo)的EPCs膠管形成能力;在心肌梗死大鼠模型中，siRNA干擾Nrf2顯著減少移植EPCs的生存，伴隨著心肌梗死交界區(qū)毛細(xì)血管數(shù)目減少;過表達(dá)N

10、rf2則顯著促進(jìn)移植EPCs的生存，增加心肌梗死交界區(qū)毛細(xì)血管毛細(xì)血管數(shù)目。
　　結(jié)論：
　　1)密度梯度離心加貼壁培養(yǎng)法可以獲得較大數(shù)量和高純度的EPCs;細(xì)胞內(nèi)吞試驗(yàn)和細(xì)胞表面抗原標(biāo)記CD34、CD133、KDR和CD31鑒定證實(shí)為EPCs。
　　2) siRNA干擾Nrf2后加重缺氧誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并抑制細(xì)胞增殖能力，降低細(xì)胞遷移能力;而高表達(dá)Nrf2抑制缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)細(xì)胞遷移能力，但對(duì)細(xì)胞增殖能力無影響

11、，這些結(jié)果表明，Nrf2有利于維持缺氧微環(huán)境中的細(xì)胞生存。同時(shí)，Nrf2正性調(diào)節(jié)缺氧預(yù)處理的EPCs的旁分泌功能。
　　3)膠管形成試驗(yàn)和動(dòng)物在體心肌梗死模型實(shí)驗(yàn)顯示，Nrf2參與缺氧誘導(dǎo)的血管生成作用。這個(gè)可能是EPCs-Nrf2較EPCs移植治療具有更好改善心功能的原因。
　　4)缺氧誘導(dǎo)EPCs產(chǎn)生ROS，并激活Nrf2核內(nèi)轉(zhuǎn)位。
　　5)缺氧通過激活細(xì)胞PI3K/Akt信號(hào)途徑而誘導(dǎo)Nrf2表達(dá)增加，而Nrf2