前列腺癌核酸適配體的篩選及性質(zhì)考察.pdf

1、前列腺癌在男性中是除肺癌外最常見的惡性腫瘤。目前，針對(duì)前列腺癌的早期篩查診斷的主要依據(jù)是前列腺癌特異性抗原(PSA)水平的變化，然而這種方法缺乏特異性且PSA在非癌變的前列腺細(xì)胞中也會(huì)變化。另外，目前臨床上治療癌癥時(shí)面臨的一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)是腫瘤的轉(zhuǎn)移性，其在癌癥的發(fā)生和轉(zhuǎn)變過(guò)程中往往具有很大的危險(xiǎn)性。因此，尋找能特異性識(shí)別具有轉(zhuǎn)移潛能的前列腺癌的生物分子，用于早期檢測(cè)、分型及治療是目前前列腺癌生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的前沿課題。核酸適配體是20-

2、80 nt的單鏈DNA或者RNA分子，通過(guò)形成三維結(jié)構(gòu)與靶標(biāo)分子特異性識(shí)別并結(jié)合。由于核酸適配體具有易于合成和修飾，特異性好，與靶標(biāo)結(jié)合親和力高等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)在生物醫(yī)學(xué)，生物化學(xué)等領(lǐng)域有了飛速發(fā)展，成為研究腫瘤的一種新穎而高效的手段，在未來(lái)生物醫(yī)學(xué)和臨床研究中具有不可估量的應(yīng)用前景。在此背景下，我們利用核酸適配體篩選技術(shù)得到一條特異性針對(duì)前列腺癌的核酸適配體，為前列腺癌的早期診斷，分型和治療提供了新的線索和研究方向。
　　本論文基

3、于Cell-SELEX技術(shù)，以雄激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞株DU145為研究對(duì)象，開展能特異識(shí)別前列腺癌的核酸適體篩選工作，對(duì)篩選得到的核酸適配體性質(zhì)進(jìn)行了多方面的考察，并對(duì)其靶標(biāo)類型進(jìn)行了初步鑒定，本論文所篩選出來(lái)的核酸適配體有望成為前列腺癌診斷和治療的新型標(biāo)記分子，并對(duì)日后發(fā)現(xiàn)前列腺癌的分子標(biāo)記物提供了重要線索。
　　本論文主要研究?jī)?nèi)容包括:
　　(1)前列腺癌細(xì)胞株DU145特異性核酸適配體的篩選
　　本工作以雄激

4、素非依賴性前列腺癌細(xì)胞株DU145為靶細(xì)胞，以人正常前列腺基質(zhì)永生化細(xì)胞株WPMY-1為對(duì)照細(xì)胞，采用Cell-SELEX技術(shù)進(jìn)行核酸適配體的篩選。經(jīng)過(guò)18輪篩選后，通過(guò)高通量測(cè)序，挑選和驗(yàn)證，得到一條能與前列腺癌細(xì)胞株DU145特異結(jié)合的核酸適配體DML-7。
　　(2)核酸適配體DML-7的性質(zhì)考察
　　為了使得到的核酸適配體能更好地應(yīng)用于前列腺癌的檢測(cè)和治療，我們對(duì)核酸適配體DML-7的多方面性質(zhì)進(jìn)行了考察。通過(guò)核酸適

5、配體的二級(jí)結(jié)構(gòu)模擬和流式細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)分析了該核酸適配體刪減后與靶細(xì)胞的結(jié)合情況，確定篩選所得到的核酸適配體兩端引物序列在結(jié)合靶標(biāo)上也起著重要的作用，是不可缺少的部分。通過(guò)親和力檢測(cè)實(shí)驗(yàn)表明核酸適配體與靶細(xì)胞DU145的解離常數(shù)在納摩爾范圍內(nèi)，為49.4nM±5.1。通過(guò)在血清中的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表明，DML-7即使在未做任何修飾的情況下仍具有很高的穩(wěn)定性，具有應(yīng)用在活體中的潛能。并且，內(nèi)在化實(shí)驗(yàn)表明在生理情況下DML-7能進(jìn)入細(xì)胞，因而可以作

6、為特異性的分子探針，為應(yīng)用于靶向給藥和靶向治療奠定了重要的基礎(chǔ)。進(jìn)一步通過(guò)用不同蛋白酶處理細(xì)胞膜表面蛋白的實(shí)驗(yàn)表明，該條核酸適配體可能與細(xì)胞膜上的某種可抵抗酶作用或者糖基化程度比較高的蛋白質(zhì)結(jié)合。另外，還考察了DML-7識(shí)別其他腫瘤細(xì)胞的能力，DML-7能與雄性激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞和部分貼壁細(xì)胞特異性的結(jié)合，而不能與懸浮細(xì)胞結(jié)合，推測(cè)DML-7與細(xì)胞結(jié)合的靶標(biāo)分子可能與細(xì)胞的粘附和轉(zhuǎn)移相關(guān)。通過(guò)組織芯片成像技術(shù)從臨床復(fù)雜樣品的組織水