基于核酸適配體的幾種致病微生物新型檢測與防治方法的建立與應(yīng)用.pdf

1、沙門氏菌是最常見的食源性疾病病源體?？刂粕抽T氏菌感染的有效措施之一，是將食品和臨床標(biāo)本中的致病菌快速而準(zhǔn)確地檢測出來，以便及時采取應(yīng)對措施。由于沙門氏菌傳統(tǒng)檢測方法的諸多局限性，研發(fā)操作簡便、結(jié)果可靠、成本低廉、快速高效的檢測新方法備受國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注。另一類嚴重威脅人類身體健康的致病微生物是流感病毒，由它引起的流感是最嚴重的傳染病之一。流感的治療通常采用M2離子通道阻滯劑和神經(jīng)氨酸酶抑制劑，但流感病毒的快速變異催生了越來越多的耐藥毒株，

2、致使常規(guī)藥物的療效不斷降低。因此，揭示新的藥物作用機制、開發(fā)新型防治藥物是流感治療工作中亟待解決的問題。鑒于此，我們試圖以核酸適配體為工具，針對幾種當(dāng)前給人類健康帶來巨大威脅的病原微生物建立一個快速高效的檢測和防治平臺。圍繞這一主題，本研究以鼠傷寒沙門氏菌（S.typhimurium）、甲型副傷寒沙門氏菌(S.paratyphiA)鞭毛蛋白和H1N1流感病毒血凝素(H1N1-HA)為實驗材料，開展了以下幾方面的工作:
　　1、通過

3、Cell-SELEX篩選S.typhimurium核酸適配體。以S.typhimurium菌體作為Cell-SELEX的靶標(biāo)，篩選出6條DNA適配體，親和力和特異性鑒定結(jié)果顯示，它們的解離常數(shù)(Kd值)均小于100nM，其中StmApt6親和力最高，Kd僮為30±4nM，且在S.typhimurium以及一些其他的菌種如豬霍亂沙門氏菌(S.choleraesuis）、甲型副傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌（S.aureus）和大腸桿菌(E.

4、Coli) K88之間有著良好的區(qū)分度。
　　2、通過常規(guī)SELEX技術(shù)篩選S.paratyphi A鞭毛蛋白和H1N1流感病毒HA核酸適配體。以純化的S.paratyphi A鞭毛蛋白和純化的H1N1-HA為靶標(biāo)，采用常規(guī)SELEX技術(shù)，篩選出了4條S.paratyphi A鞭毛蛋白的DNA適配體和2條H1N1-HA的DNA適配體，親和力鑒定結(jié)果顯示，它們的Kd值均小于100 nM，其中分別以鞭毛蛋白適配體FlagApt3和HA

5、蛋白適配體HaApt1的親和力最高，其Kd值分別為27±27 nM和78±1nM。
　　3、采用核酸適配體和氧化石墨烯構(gòu)建S.typhimurium檢測系統(tǒng)。將上述StmApt6的5'端以FAM作修飾，再與氧化石墨烯非共價結(jié)合，構(gòu)建了一個基于碳納米材料的熒光適配體傳感器。該傳感器可以快速有效地對S.typhimurium進行檢測，在理想的實驗條件下，其靈敏度可達到100 CFU/mL，線性范圍為103～108 CFU/mL，以牛奶

6、為實際樣品對該系統(tǒng)進行性能檢驗，結(jié)果顯示該系統(tǒng)對牛奶中的靶菌仍有著良好的反應(yīng)性，提示它對食品中S.typhimurium的定性和定量檢測有著一定的實際應(yīng)用價值。
　　4、采用核酸適配體和單壁碳納米管構(gòu)建S.paratyphi A檢測系統(tǒng)。將上述FlagApt3去除部分固定序列后，在其5'端以FITC作修飾，3'端共價連接一段DNA酶序列，制成一個帶熒光素的分子探針，然后將其與碳納米管非共價結(jié)合，構(gòu)建了一個雙重信號檢測系統(tǒng)。樣品中S

7、.paratyphi A的量可以通過系統(tǒng)檢測到的熒光值或吸光度值來求出。利用該系統(tǒng)進行牛奶樣品中S.paratyphi A的定量測定，可檢出105 CFU/mL（熒光法）和106 CFU/mL（分光光度法）的目標(biāo)菌。由于采用兩種信號分別對同一目標(biāo)菌進行檢測，該方法大大地減少了假陽性率產(chǎn)生的可能性，使檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性與可靠性得到顯著提升。
　　5、采用核酸適配體進行抗流感病毒感染的研究。以上述HaApt1進行紅細胞凝集抑制試驗和微量

8、中和試驗，結(jié)果顯示，HaApt1能有效地抑制H1N1（A/Puerto Rico/8/1934）流感病毒所致的紅細胞凝集，直接阻止H1N1流感病毒在培養(yǎng)的MDCK細胞上的吸附及對該細胞的感染，使病毒在細胞中的復(fù)制顯著減少。根據(jù)實驗結(jié)果初步判斷，HaApt1能與H1N1血凝素蛋白關(guān)鍵位點發(fā)生緊密結(jié)合，阻斷病毒與宿主細胞受體之間的相互作用。因此，HaApt1對于開展流感病毒HA-宿主細胞分子間相互作用的研究，以及抗流感病毒感染藥物的開發(fā)具有