改變microRNA-21的表達(dá)在人肺癌細(xì)胞體外生長和遷移中的作用研究.pdf

1、目的：觀察改變miRNA-21表達(dá)對人肺癌細(xì)胞體外生長和遷移中的作用，并探討其分子機(jī)制。
　　方法：⑴利用分子克隆技術(shù)構(gòu)建 miRNA-21過表達(dá)載體（命名為 p-miR-21）；體外將p-miR-21和前期構(gòu)建的pcDNA-6.2-miRNA-21-ASOs（命名為p-miR-21-ASOs）載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入人肺癌95D細(xì)胞中；Real-time PCR技術(shù)檢測miR-21成熟體的表達(dá)水平，腫瘤細(xì)胞生長周期相關(guān)的周期蛋白依賴性激酶

2、 CDK2、CDK3、CDK4和 CDK6，以及腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)分子MMP-2、MMP-9、E-cadherin和CXCR4的表達(dá)變化；利用CCK-8和Scratch assay檢測改變miR-21表達(dá)對人肺癌95D細(xì)胞體外增殖和遷移的影響；利用Transwell技術(shù)檢測95D細(xì)胞的遷移和侵襲能力變化；最后利用Western blot檢測相關(guān)信號(hào)途徑，包括Akt/mTOR、Erk等途徑的傳遞改變。⑵運(yùn)用生物信息學(xué)技術(shù)初步篩選出miR-2

3、1可能的候選靶分子；Real-time PCR檢測p-miR-21-ASOs和 p-miR-21轉(zhuǎn)染入人肺癌95D細(xì)胞后，候選靶分子的表達(dá)變化；Western blot技術(shù)驗(yàn)證其表達(dá)。利用RNAi技術(shù)合成miR-21靶分子LEMD3的RNAi干擾序列（命名為si-LEMD3），體外瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入人肺癌95D細(xì)胞；Real-time PCR和Western blot技術(shù)檢測細(xì)胞中LEMD3的表達(dá)變化；CCK-8法和Scratch assay觀

4、察干擾LEMD3表達(dá)后對95D細(xì)胞體外增殖和遷移的影響；克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞克隆形成能力的改變；Real-time PCR技術(shù)檢測細(xì)胞中生長周期相關(guān)的周期蛋白依賴性激酶CDK2、CDK3、CDK4和 CDK6，以及腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)分子 MMP-2、MMP-9、E-cadherin和CXCR4的表達(dá)變化；最后，利用Western blot檢測相關(guān)信號(hào)途徑，包括Akt/mTOR、Erk等途徑的傳遞改變。隨后，將p-miR-21-ASOs載體

5、（4μg）和si-LEMD3干擾序列（50 nM）共轉(zhuǎn)染入人肺癌95D細(xì)胞中；CCK-8法和Scratch assay法觀察人肺癌95D細(xì)胞體外增殖和遷移的影響；克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察95D細(xì)胞克隆形成能力的改變；Real-time PCR檢測細(xì)胞中生長周期相關(guān)的周期蛋白依賴性激酶CDK2、CDK3、CDK4和CDK6的表達(dá)變化以及轉(zhuǎn)移相關(guān)分子MMP-2、MMP-9、E-cadherin和CXCR4等的表達(dá)變化；最后，利用Western bl

6、ot技術(shù)檢測LEMD3蛋白、磷酸化Akt、磷酸化Erk以及總Akt、Erk蛋白的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：①經(jīng)鑒定成功構(gòu)建 miRNA-21過表達(dá)載體 p-miR-21；與 p-Cont對照組相比， p-miR-21-ASOs轉(zhuǎn)染組中miR-21的表達(dá)顯著下調(diào)(P＜0.05)，而p-miR-21轉(zhuǎn)染組中的表達(dá)顯著上調(diào)(P＜0.05)；且 p-miR-21-ASOs轉(zhuǎn)染組腫瘤細(xì)胞數(shù)隨著劑量的增加逐漸減少(P＜0.05)，而p-miR-2

7、1轉(zhuǎn)染組中腫瘤細(xì)胞數(shù)隨著劑量的增加逐漸增多(P＜0.05)；與p-Cont組相比，p-miR-21-ASOs轉(zhuǎn)染組95D細(xì)胞的增殖和遷移能力均明顯降低(P＜0.05)，而p-miR-21轉(zhuǎn)染組中95D細(xì)胞則明顯增強(qiáng)(P＜0.05)；與p-Cont對照組相比，p-miR-21-ASOs轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的侵襲和遷移數(shù)減少，而 p-miR-21轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的則增多(P＜0.05)；與p-Cont對照組相比，p-miR-21-ASOs轉(zhuǎn)染組中95D細(xì)胞

8、生長周期相關(guān)的周期蛋白依賴性激酶CDK2、CDK3、CDK4和CDK6的表達(dá)均顯著下調(diào)(P＜0.05)，而p-miR-21轉(zhuǎn)染組中的表達(dá)均顯著上調(diào)(P＜0.05)，此外，p-miR-21-ASOs轉(zhuǎn)染組中腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)分子 E-cadherin的表達(dá)上調(diào)，MMP-2、MMP-9和 CXCR4的表達(dá)均下調(diào)(P＜0.05)，而 p-miR-21轉(zhuǎn)染組中 E-cadherin的表達(dá)下調(diào)，MMP-2、MMP-9和CXCR4的表達(dá)均顯著上調(diào)(P

9、＜0.05)； p-miR-21-ASOs轉(zhuǎn)染組中95D細(xì)胞中磷酸化Akt和磷酸化Erk蛋白的表達(dá)均明顯下調(diào)(P＜0.05)，而p-miR-21轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中磷酸化Akt和磷酸化Erk蛋白的表達(dá)均明顯上調(diào)(P＜0.05)。②篩選出miR-21的候選10個(gè)靶分子，p-miR-21-ASOs轉(zhuǎn)染組95D細(xì)胞中抑癌靶基因SOCS6、HBP1、PTEN、PDCD4、RECK、SPRY1、TIMP3明顯上調(diào)(P＜0.05)，促癌靶基因 TIAM1、

10、PIK3R1、HIF1α明顯下調(diào)的(P＜0.05)；與之相反，p-miR-21轉(zhuǎn)染組中的這些抑癌靶基因是下調(diào)的(P＜0.05)，而促癌靶基因均明顯上調(diào)(P＜0.05)；結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，篩選出miR-21可能的新候選靶分子LEMD3；與p-Cont組相比， p-miR-21-ASOs轉(zhuǎn)染組 LEMD3的表達(dá)均表達(dá)上調(diào)(P＜0.05)；而 p-miR-21轉(zhuǎn)染組LEMD3的表達(dá)均表達(dá)下調(diào)(P＜0.05)，提示LEMD3為miR-21的新靶

11、分子。si-LEMD3轉(zhuǎn)染組中的LEMD3 mRNA水平和蛋白表達(dá)均表達(dá)下調(diào)(P＜0.05)，且細(xì)胞數(shù)較Control組明顯增加；與Control組相比，si-LEMD3轉(zhuǎn)染組95D細(xì)胞的增殖和遷移能力均明顯增強(qiáng)(P＜0.05)，且腫瘤細(xì)胞克隆形成能力明顯增加(P＜0.05)；與Control對照組相比，si-LEMD3轉(zhuǎn)染組中95D細(xì)胞生長周期相關(guān)的周期蛋白依賴性激酶CDK2、CDK3、CDK4和CDK6的表達(dá)均顯著上調(diào)(P＜0.05

12、)，而腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)分子除E-cadherin的mRNA下調(diào)外，其余三個(gè)MMP-2、MMP-9和CXCR4的mRNA均表達(dá)上調(diào)(P＜0.05)；與Control對照組相比，si-LEMD3轉(zhuǎn)染組95D細(xì)胞中磷酸化Akt和磷酸化Erk蛋白的表達(dá)均明顯上調(diào)(P＜0.05)。與 p-miR-21-ASOs+si-control對照組相比， p-miR-21-ASOs和si-LEMD3共轉(zhuǎn)染組95D細(xì)胞中LEMD3蛋白表達(dá)均明顯減少(P＜0.

13、05)；且細(xì)胞數(shù)顯著增多；與 p-miR-21-ASOs+si-control對照組相比， p-miR-21-ASOs+si-LEMD3轉(zhuǎn)染組95D細(xì)胞的增殖和遷移能力均顯著增強(qiáng)(P＜0.05)，同時(shí)腫瘤細(xì)胞克隆形成能力明顯增加(P＜0.05)；與p-miR-21-ASOs+si-cont對照組相比，p-miR-21-ASOs+si-cont轉(zhuǎn)染組中95D細(xì)胞CDK2、CDK3、CDK4和CDK6的表達(dá)均顯著上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P

14、＜0.05)，腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)分子除E-cadherin的mRNA均表達(dá)下調(diào)，其余三個(gè)MMP-2、MMP-9和CXCR4的mRNA均表達(dá)上調(diào)(P＜0.05)；與 p-miR-21-ASOs+si-control對照組相比，p-miR-21-ASOs+si-LEMD3轉(zhuǎn)染組95D細(xì)胞中磷酸化Akt和磷酸化Erk蛋白的表達(dá)均明顯上調(diào)，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　結(jié)論：⑴改變miR-21的表達(dá)可顯著影響人肺癌細(xì)胞的體外生長和