改變microRNA-21的表達在人肺癌細胞體外生長和遷移中的作用研究.pdf

1、目的：觀察改變miRNA-21表達對人肺癌細胞體外生長和遷移中的作用，并探討其分子機制。
　　方法：⑴利用分子克隆技術構建 miRNA-21過表達載體（命名為 p-miR-21）；體外將p-miR-21和前期構建的pcDNA-6.2-miRNA-21-ASOs（命名為p-miR-21-ASOs）載體瞬時轉染入人肺癌95D細胞中；Real-time PCR技術檢測miR-21成熟體的表達水平，腫瘤細胞生長周期相關的周期蛋白依賴性激酶

2、 CDK2、CDK3、CDK4和 CDK6，以及腫瘤細胞轉移相關分子MMP-2、MMP-9、E-cadherin和CXCR4的表達變化；利用CCK-8和Scratch assay檢測改變miR-21表達對人肺癌95D細胞體外增殖和遷移的影響；利用Transwell技術檢測95D細胞的遷移和侵襲能力變化；最后利用Western blot檢測相關信號途徑，包括Akt/mTOR、Erk等途徑的傳遞改變。⑵運用生物信息學技術初步篩選出miR-2

3、1可能的候選靶分子；Real-time PCR檢測p-miR-21-ASOs和 p-miR-21轉染入人肺癌95D細胞后，候選靶分子的表達變化；Western blot技術驗證其表達。利用RNAi技術合成miR-21靶分子LEMD3的RNAi干擾序列（命名為si-LEMD3），體外瞬時轉染入人肺癌95D細胞；Real-time PCR和Western blot技術檢測細胞中LEMD3的表達變化；CCK-8法和Scratch assay觀

4、察干擾LEMD3表達后對95D細胞體外增殖和遷移的影響；克隆形成實驗觀察細胞克隆形成能力的改變；Real-time PCR技術檢測細胞中生長周期相關的周期蛋白依賴性激酶CDK2、CDK3、CDK4和 CDK6，以及腫瘤細胞轉移相關分子 MMP-2、MMP-9、E-cadherin和CXCR4的表達變化；最后，利用Western blot檢測相關信號途徑，包括Akt/mTOR、Erk等途徑的傳遞改變。隨后，將p-miR-21-ASOs載體

5、（4μg）和si-LEMD3干擾序列（50 nM）共轉染入人肺癌95D細胞中；CCK-8法和Scratch assay法觀察人肺癌95D細胞體外增殖和遷移的影響；克隆形成實驗觀察95D細胞克隆形成能力的改變；Real-time PCR檢測細胞中生長周期相關的周期蛋白依賴性激酶CDK2、CDK3、CDK4和CDK6的表達變化以及轉移相關分子MMP-2、MMP-9、E-cadherin和CXCR4等的表達變化；最后，利用Western bl

6、ot技術檢測LEMD3蛋白、磷酸化Akt、磷酸化Erk以及總Akt、Erk蛋白的表達水平。
　　結果：①經鑒定成功構建 miRNA-21過表達載體 p-miR-21；與 p-Cont對照組相比， p-miR-21-ASOs轉染組中miR-21的表達顯著下調(P＜0.05)，而p-miR-21轉染組中的表達顯著上調(P＜0.05)；且 p-miR-21-ASOs轉染組腫瘤細胞數隨著劑量的增加逐漸減少(P＜0.05)，而p-miR-2

7、1轉染組中腫瘤細胞數隨著劑量的增加逐漸增多(P＜0.05)；與p-Cont組相比，p-miR-21-ASOs轉染組95D細胞的增殖和遷移能力均明顯降低(P＜0.05)，而p-miR-21轉染組中95D細胞則明顯增強(P＜0.05)；與p-Cont對照組相比，p-miR-21-ASOs轉染組細胞的侵襲和遷移數減少，而 p-miR-21轉染組細胞的則增多(P＜0.05)；與p-Cont對照組相比，p-miR-21-ASOs轉染組中95D細胞

8、生長周期相關的周期蛋白依賴性激酶CDK2、CDK3、CDK4和CDK6的表達均顯著下調(P＜0.05)，而p-miR-21轉染組中的表達均顯著上調(P＜0.05)，此外，p-miR-21-ASOs轉染組中腫瘤細胞轉移相關分子 E-cadherin的表達上調，MMP-2、MMP-9和 CXCR4的表達均下調(P＜0.05)，而 p-miR-21轉染組中 E-cadherin的表達下調，MMP-2、MMP-9和CXCR4的表達均顯著上調(P

9、＜0.05)； p-miR-21-ASOs轉染組中95D細胞中磷酸化Akt和磷酸化Erk蛋白的表達均明顯下調(P＜0.05)，而p-miR-21轉染組細胞中磷酸化Akt和磷酸化Erk蛋白的表達均明顯上調(P＜0.05)。②篩選出miR-21的候選10個靶分子，p-miR-21-ASOs轉染組95D細胞中抑癌靶基因SOCS6、HBP1、PTEN、PDCD4、RECK、SPRY1、TIMP3明顯上調(P＜0.05)，促癌靶基因 TIAM1、

10、PIK3R1、HIF1α明顯下調的(P＜0.05)；與之相反，p-miR-21轉染組中的這些抑癌靶基因是下調的(P＜0.05)，而促癌靶基因均明顯上調(P＜0.05)；結合相關文獻報道，篩選出miR-21可能的新候選靶分子LEMD3；與p-Cont組相比， p-miR-21-ASOs轉染組 LEMD3的表達均表達上調(P＜0.05)；而 p-miR-21轉染組LEMD3的表達均表達下調(P＜0.05)，提示LEMD3為miR-21的新靶

11、分子。si-LEMD3轉染組中的LEMD3 mRNA水平和蛋白表達均表達下調(P＜0.05)，且細胞數較Control組明顯增加；與Control組相比，si-LEMD3轉染組95D細胞的增殖和遷移能力均明顯增強(P＜0.05)，且腫瘤細胞克隆形成能力明顯增加(P＜0.05)；與Control對照組相比，si-LEMD3轉染組中95D細胞生長周期相關的周期蛋白依賴性激酶CDK2、CDK3、CDK4和CDK6的表達均顯著上調(P＜0.05

12、)，而腫瘤細胞轉移相關分子除E-cadherin的mRNA下調外，其余三個MMP-2、MMP-9和CXCR4的mRNA均表達上調(P＜0.05)；與Control對照組相比，si-LEMD3轉染組95D細胞中磷酸化Akt和磷酸化Erk蛋白的表達均明顯上調(P＜0.05)。與 p-miR-21-ASOs+si-control對照組相比， p-miR-21-ASOs和si-LEMD3共轉染組95D細胞中LEMD3蛋白表達均明顯減少(P＜0.

13、05)；且細胞數顯著增多；與 p-miR-21-ASOs+si-control對照組相比， p-miR-21-ASOs+si-LEMD3轉染組95D細胞的增殖和遷移能力均顯著增強(P＜0.05)，同時腫瘤細胞克隆形成能力明顯增加(P＜0.05)；與p-miR-21-ASOs+si-cont對照組相比，p-miR-21-ASOs+si-cont轉染組中95D細胞CDK2、CDK3、CDK4和CDK6的表達均顯著上調，差異具有統(tǒng)計學意義(P

14、＜0.05)，腫瘤細胞轉移相關分子除E-cadherin的mRNA均表達下調，其余三個MMP-2、MMP-9和CXCR4的mRNA均表達上調(P＜0.05)；與 p-miR-21-ASOs+si-control對照組相比，p-miR-21-ASOs+si-LEMD3轉染組95D細胞中磷酸化Akt和磷酸化Erk蛋白的表達均明顯上調，且具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　結論：⑴改變miR-21的表達可顯著影響人肺癌細胞的體外生長和