G3BP1在乳腺癌與肺癌細(xì)胞體外遷移中作用的研究.pdf

1、目的:研究GTP酶激活蛋白-Src同源結(jié)構(gòu)域3-結(jié)合蛋白1[GTPase activatingprotein-(Src homology domain3)-binding protein1，G3BP1]是否參與了人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231及人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549的體外遷移過程，并在結(jié)果為陽性的前提下嘗試提出可能的理論機(jī)制。
　　 方法:
　　 一:免疫印跡法檢測MDA-MB-231中G3BP1表達(dá)水平是否與

2、文獻(xiàn)報(bào)道一致;向MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染以G3BP1的mRNA為靶點(diǎn)的小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）以抑制G3BP1的表達(dá);趨化實(shí)驗(yàn)檢測抑制G3BP1表達(dá)后MDA-MB-231細(xì)胞穿過10μm聚碳酸酯膜的數(shù)量;10ng/ml表皮生長因子（epidermal growth factor, EGF）分別刺激30s、1min、2min以及5min時(shí)MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)G3BP1，PKCζ，A

3、kt，pPKCζThr410/403和pAktser473的表達(dá)情況。免疫共沉淀法檢測MDA-MB-231內(nèi)G3BP1是否與PKCζ存在相互作用。
　　 二:以MDA-MB-231為陽性對(duì)照，免疫印跡法檢測A549內(nèi)G3BP1的表達(dá)情況;A549細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染以G3BP1的mRNA為靶點(diǎn)的siRNA以抑制G3BP1的表達(dá);趨化實(shí)驗(yàn)、體外侵襲實(shí)驗(yàn)及劃痕實(shí)驗(yàn)分別檢測A549細(xì)胞穿過8μm聚碳酸酯膜、人工基底膜(matrigel)的數(shù)量，

4、以及在無外源趨化誘導(dǎo)物刺激情況下定向運(yùn)動(dòng)距離。最后，免疫印跡法檢測G3BP1在另外3種肺癌細(xì)胞系GLC-82、H1299以及NCI-H358中的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果:
　　 一:經(jīng)免疫印跡法檢測，G3BP1在乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231細(xì)胞中表達(dá)異常升高，與文獻(xiàn)報(bào)道一致;轉(zhuǎn)染siRNA后經(jīng)免疫印跡法檢測MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)的G3BP1表達(dá)被完全抑制;趨化實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)分別顯示在內(nèi)源性G3BP1表達(dá)被抑制的情況下

5、，MDA-MB-231細(xì)胞在體外穿過8μm聚碳酸酯膜的數(shù)量、無外源趨化誘導(dǎo)物刺激情況下定向運(yùn)動(dòng)距離均比G3BP1未被抑制的MDA-MB-231細(xì)胞顯著下降(P＜0.05);10ng/mlEGF分別刺激30s、1min、2 min以及5min，MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)G3BP1，蛋白激酶Cζ(protein kinase Cζ，PKCζ)與蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)表達(dá)水平幾乎無變化，pPKCζThr410/

6、403、pAktser473及pAkt表達(dá)水平隨外源EGF刺激時(shí)間延長而逐漸增加，至5min時(shí)達(dá)到峰值。MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)G3BP1與PKCζ存在相互作用。
　　 二:經(jīng)免疫印跡法檢測，G3BP1在A549中的表達(dá)水平與其在MDA-MB-231中非常接近，故可以推測其在A549中表達(dá)同樣異常升高;轉(zhuǎn)染siRNA后經(jīng)免疫印跡法檢測A549細(xì)胞內(nèi)的G3BP1表達(dá)被完全抑制;趨化實(shí)驗(yàn)、體外侵襲實(shí)驗(yàn)以及劃痕實(shí)驗(yàn)分別顯示在內(nèi)源性G

7、3BP1表達(dá)被抑制的情況下，A549細(xì)胞穿過8μm聚碳酸酯膜、人工基底膜的數(shù)量、無外源趨化誘導(dǎo)物刺激情況下定向運(yùn)動(dòng)距離以及在體外穿過人工基底膜的細(xì)胞數(shù)量均比未被抑制G3BP1表達(dá)的A549細(xì)胞顯著下降(P＜0.05)。最后，免疫印跡法檢測在GLC-82、H1299以及NCI-H358細(xì)胞中，G3BP1的表達(dá)水平并不一致，具體表現(xiàn)為G3BP1在GLC-82以及H1299中表達(dá)水平升高，而在NCI-H358中表達(dá)水平降低。
　　 結(jié)

8、論:G3BP1在人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231中表達(dá)水平異常升高，而其表達(dá)被抑制后MDA-MB-231的趨化以及定向運(yùn)動(dòng)能力均顯著下降，表明G3BP1很有可能參與了乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的遷移過程，并在該過程中發(fā)揮重要作用。由于PKCζ及其信號(hào)通路下游分子Akt的磷酸化水平隨外源趨化因子刺激時(shí)間增加而增加，且G3BP1與PKCζ存在相互作用，故推測G3BP1可能通過PKCζ-Akt信號(hào)通路參與了MDA-MB-231的遷移過程