中國對蝦氧位-甲基轉(zhuǎn)移酶基因克隆、表達分析與功能研究 附：泥鰍CD59基因克隆、表達分析與重組表達研究.pdf

1、病害一直是困擾水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的最大問題，研究水產(chǎn)養(yǎng)殖品種的抗病相關(guān)基因，利用其本身的抗病因子加強抗病力，發(fā)展新的免疫防治對策，取代或減少藥物使用是水產(chǎn)養(yǎng)殖品種病害防治的根本。本論文從細菌刺激的中國對蝦中克隆了一個氧位一甲基轉(zhuǎn)移酶基因，從細菌刺激的泥鰍中克隆了一個CD59基因，并對這兩個基因進行了表達模式和功能研究，結(jié)果如下： 一、首次克隆了中國對蝦COMT基因 兒茶酚一氧位-甲基轉(zhuǎn)移酶(Catech01-O-methy

2、ltransferase，簡稱COMT,E.C.2.1.1.6)是一種氧位．甲基轉(zhuǎn)移酶。盡管氧位．甲基轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)甲基的化學機制都是一樣的，但由于甲基受體分子的不同，氧位．甲基轉(zhuǎn)移酶的種類也有所不同。動物有兩種氧位-甲基轉(zhuǎn)移酶被廣為研究：一種是法呢酸一氧位一甲基轉(zhuǎn)移酶(farnesoic acid-O-methyltransferase，簡稱FAMeT)：另一種就是COMT。通過對甲殼動物：FAMeT的研究得知，F(xiàn)AMeT是催化法呢酸甲基化

3、反應生成法呢酸甲酯的氧位-甲基轉(zhuǎn)移酶，對甲殼動物的生長、卵巢發(fā)育和蛻皮具有調(diào)控作用。COMT可以催化S腺苷蛋氨酸的一個甲基轉(zhuǎn)移到含兒茶酚結(jié)構(gòu)的底物分子上，形成甲基化的產(chǎn)物，所以，COMT可以滅活兒茶酚胺類以及其它的兒茶酚型化合物，當然，也包括含有兒茶酚結(jié)構(gòu)的有毒物質(zhì)和臨床藥物。 自從1958年人的COMT被首次發(fā)現(xiàn)以來，COMT在脊椎動物和無脊椎動物中都有發(fā)現(xiàn)，然而，關(guān)于甲殼類COMT的研究還未見報道。 本文利用抑制

4、性消減雜交技術(shù)(SSH)和SMART cDNA方法，克隆了中國對蝦COMT基因，該基因全長cDNA序列已提交給GenBank，登錄號為DQ091255。中國對蝦COMT基因全長917bp，含有一個完整的開放閱讀框，編碼的成熟肽由221個氨基酸組成，其理論分子量是24572.06 Da，等電點是5.27，推測該成熟肽有10個磷酸化的氨基酸位點，不具信號肽，說明中國對蝦COMT不分泌到循環(huán)的血液中，而是依賴特定氨基酸的磷酸化起調(diào)控作用。另外

5、，推測中國對蝦COMT中第18-221個氨基酸殘基構(gòu)成了一個保守區(qū)，該保守區(qū)屬于甲基轉(zhuǎn)移酶-3家族。 甲基轉(zhuǎn)移酶-3家族成員很多，包括COMT、細菌氧位一甲基轉(zhuǎn)移酶(簡寫為OMT)和咖啡酰輔酶A-氧位-甲基轉(zhuǎn)移酶(簡寫為CCoAOMT)。通過氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)，本文克隆的中國對蝦COMT基因與人和其它的哺乳動物的COMTS具有較高的的同源性，而與甲殼動物十足目的FAMeTs沒有重要的序列相似性。系統(tǒng)發(fā)育分析也將本文克隆的中國

6、對蝦COMT基因與其它物種的COMTS歸為同一類群，而與甲殼動物的FAMeTS分屬不同類群，依此推論中國對蝦氧位．甲基轉(zhuǎn)移酶基因不屬于FAMeTS，而可能為COMTS的一個新成員。 二、中國對蝦COMT基因表達研究 用Northern blot在細菌刺激的和正常的對蝦血細胞、肝胰腺、心臟、胃、鰓、腸和卵巢中均檢測到中國對蝦COMT基因的單一表達帶，而且信號強度不同，心臟和鰓中的信號最弱，肝胰腺中的信號最強，另外，在細

7、菌刺激的肝胰腺、胃中呈上調(diào)表達。 原位雜交結(jié)果顯示，中國對蝦COMT基因的mRNA在正常對蝦的血細胞、肝胰腺、胃、腸和卵巢中均有轉(zhuǎn)錄，而正常對蝦的心臟和鰓中未檢測到中國對蝦COMT基因的轉(zhuǎn)錄本。顯然，中國對蝦COMT基因在對蝦組織中是廣為分布，在對蝦的血細胞、肝胰腺中高表達，在對蝦的心臟和鰓中低表達，而且在細菌刺激的肝胰腺、胃中呈上調(diào)表達，這些結(jié)果表明中國對蝦COMT基因可能對對蝦有多種功能，尤其可能參與了對細菌感染的免

8、疫反應。 三、中國對蝦COMT重組表達與功能研究 為了驗證中國對蝦COMT基因的功能，用合成的基因特異引物Met-Ex-F1與Met-Ex-R1，將中國對蝦COMT基因的表達框(ORF)擴增并克隆到原核表達載體pET-30a(+)中，構(gòu)建了重組表達質(zhì)粒(Comt/pET-30a(+)，并成功地在大腸桿菌BL21(DE3)菌株中進行了重組蛋白的表達。表達的重組蛋白為可溶性的，經(jīng)His-Bind親和層析柱純化得到了高純

9、度的重組蛋白。SDS-PAGE檢測該重組蛋白的分子量約為30 kDa，與預計的重組蛋白的分子量一致。同時，用高效液相色譜．質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-MS)技術(shù)檢測到了純化的中國對蝦COMT重組蛋白甲基化底物二羥苯甲酸形成的產(chǎn)物-香草酸，從而證明了純化的中國對蝦COMT重組蛋白具有兒茶酚-氧位-甲基轉(zhuǎn)移酶(COMT)的活性。該結(jié)果也進一步證明，本文克隆的中國對蝦氧位-甲基轉(zhuǎn)移酶基因就是中國對蝦COMT基因。 四、首次克隆了泥鰍CD59基

10、因 CD59是一種重要的補體調(diào)節(jié)蛋白，可以抑制膜補體復合物(MAC)的形成。CD59若在人體異常表達，容易引起血管系統(tǒng)疾病，并與炎癥和異體器官移植的超急排阻都有聯(lián)系。目前，CD59在人及多種哺乳動物中研究較多，而且也開展了軟骨魚CD59的研究，但關(guān)于硬骨魚類CD59基因結(jié)構(gòu)及表達模式的研究還未見報道。 本文利用同源克隆的方法，首次克隆了泥鰍CD59基因?；蛉L611bp，包含一個282bp開放閱讀框(ORF)，編

11、碼94個氨基酸，其中有10個半胱氨酸，用于形成5個二硫鍵，還有預測的2個N端酰基化位點(12-17：GLVVSG；48-53：GCAAAR)，1個磷酸化位點(69-72：SDCE)和3個糖基化位點。在開放閱讀框5’端的第178bp后面有一個152bp的內(nèi)含子插入。 五、泥鰍CD59基因表達和組織分布的研究 利用Northem blot、RT-PCR和原位雜交等實驗技術(shù)研究了泥鰍CD59基因的mRNA在組織中的表達和分

12、布。 Northern blot結(jié)果顯示，在刺激和不刺激泥鰍的血細胞、肝胰臟和腸組織中均有一條約500nt的雜交帶，而且刺激泥鰍的肝胰臟和腸中的雜交信號比正常泥鰍的肝胰臟和腸中的雜交信號強得多。在刺激和不刺激泥鰍的腦、腎臟、鰓、卵和肌肉以及不刺激泥鰍的血細胞中沒有雜交信號。 本文還采用了RT-PCR方法對泥鰍CD59基因的mRNA在泥鰍肝胰臟和腸中的表達進行了研究，得到了與Northern blot一致的結(jié)果：刺激與不刺

13、激泥鰍的肝胰臟和腸中均存在CD59基因，而且刺激泥鰍組織中的基因表達量明顯地比正常泥鰍組織中的多。 原位雜交結(jié)果顯示，雜交信號在肝胰臟的胰腺區(qū)、腸壁最內(nèi)層的粘膜層和最外層的漿膜層較強，而在粘膜下層很弱。在血細胞中著色最強的是小的白血細胞，紅血細胞幾乎沒有著色。 以上實驗結(jié)果表明，泥鰍CD59基因在肝胰臟、腸和血細胞中表達，而且，肝胰臟和腸中的表達量明顯地高于血細胞中的表達量，另外，細菌刺激以后，泥鰍cD59基因在

14、肝胰臟和腸中上調(diào)表達，推測泥鰍CD59參與了對細菌感染的免疫防御反應。 六、泥鰍CD59基因原核表達研究 本文還利用C1359基因表達引物CD59-ExpFl和C1359-ExpRl從刺激的泥鰍肝胰臟Cdna中擴增了C1359成熟肽基因片段，將其插入Pgex-4T-1載體，構(gòu)建了表達載體cd59/Pgex-4T-1，并在E.coli表達菌株BL21(DE3)成功地表達了目的蛋白，經(jīng)過對純化方法的改進，從G1utathio