脂代謝相關(guān)基因CGI-58在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及調(diào)控機制研究.pdf

1、背景:
　　腫瘤的發(fā)生發(fā)展受到基因的不穩(wěn)定性及腫瘤微環(huán)境的雙重調(diào)控。許多證據(jù)已經(jīng)表明腫瘤微環(huán)境在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用,但其作用機制仍不清楚。纖連蛋白是腫瘤微環(huán)境中重要的細胞外基質(zhì)糖蛋白,存在不同的可變剪接變異體,其中EDA+FN特異性的高表達于多種惡性腫瘤,且與多種腫瘤的惡性表型相關(guān),但EDA對腫瘤生物學特性的影響及其具體分子機制尚不清楚。
　　代謝是機體生命活動的基本特征,正常細胞向惡性細胞的轉(zhuǎn)化過程中發(fā)生多種

2、生物學特性的改變,其中代謝重編程是其最顯著的特征之一。近年來研究發(fā)現(xiàn),某些癌基因的激活或抑癌基因的失活可調(diào)控代謝穩(wěn)態(tài)發(fā)揮其促癌或抑癌作用,且某些代謝酶本身即可作為癌基因或抑癌基因參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。腫瘤有氧糖酵解是最早被發(fā)現(xiàn)和研究的腫瘤代謝重編程,即腫瘤細胞即使在有氧環(huán)境下,也主要以糖酵解而非產(chǎn)能效率更高的線粒體氧化磷酸化的方式供能(Warburg效應)。葡萄糖和脂肪酸代謝是能量的主要來源,既往關(guān)于腫瘤代謝的研究主要集中在糖代謝,近年來

3、的研究發(fā)現(xiàn),脂代謝異常也參與調(diào)控了多種腫瘤的惡性表型,但脂代謝在惡性腫瘤中的具體作用及機制仍知之甚少。結(jié)腸癌已被證實為糖酵解異常增強的腫瘤,而腫瘤組織中脂質(zhì)的異常沉積也是其重要表型,但結(jié)腸癌中這種糖脂代謝紊亂的原因及機制尚不明確。研究證實,腫瘤微環(huán)境參與調(diào)控了腫瘤代謝的重編程,而腫瘤微環(huán)境成分EDA是否參與了對結(jié)腸癌代謝的調(diào)控仍有待于進一步探討。
　　本研究通過慢病毒載體建立EDA過表達及干擾表達的細胞模型,研究了EDA對結(jié)腸癌及

4、鼻咽癌生物學特性的影響及分子機制。同時,我們發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌中EDA的過表達可顯著抑制脂代謝相關(guān)基因CGI-58的表達活性,結(jié)腸癌中CGI-58呈現(xiàn)出特異性的表達缺失。既往研究表明,CGI-58是脂質(zhì)分解的一個強有力的活化因子,其缺乏導致脂滴大量沉積,且CGI-58缺乏的小鼠對葡萄糖利用顯著增加。因此我們猜測,結(jié)腸癌中CGI-58缺乏是導致腫瘤組織中脂質(zhì)異常沉積和糖酵解增強的重要原因。為進一步明確CGI-58在結(jié)腸癌生物學特性中的作用,我們通

5、過建立腸道CGI-58特異性敲除的ApcMin/+小鼠,CGI-58敲低和CGI-58過表達細胞,聯(lián)合人結(jié)腸癌組織標本,鑒定了CGI-58缺失在誘導代謝重編程促進結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　Wnt通路的激活與結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),CGI-58缺失導致Wnt通路的靶基因c-MET表達顯著上調(diào),提示W(wǎng)nt通路被激活。我們的研究表明,CGI-58敲低細胞及CGI-58敲除小鼠腸道腫瘤中激活Wnt通路的經(jīng)典分子β-catenin的表達

6、及核轉(zhuǎn)位并無增加。因此,我們進一步探討了CGI-58缺失經(jīng)非β-catenin依賴途徑誘導YAP/TAZ復合物核轉(zhuǎn)位,激活Wnt信號通路的分子機制。
　　為進一步探討CGI-58在其他惡性腫瘤中是否同樣具有抑癌基因功能,我們根據(jù)腫瘤突變基因數(shù)據(jù)庫COSMIC的統(tǒng)計發(fā)現(xiàn),CGI-58在神經(jīng)來源腫瘤中也呈現(xiàn)顯著缺失。黑色素瘤是神經(jīng)來源的具有高度侵襲性的惡性腫瘤,已有研究報道脂代謝相關(guān)基因MAGL可顯著促進黑色素瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力,為

7、進一步明確CGI-58在其他惡性腫瘤中是否同樣具有抑癌基因作用,通過慢病毒載體建立的CGI-58敲低及過表達黑色素瘤細胞模型,結(jié)合黑色素瘤臨床腫瘤組織標本,我們繼而研究了CGI-58在黑色素瘤分化及侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及機制。
　　目的:
　　1、闡明結(jié)腸癌微環(huán)境成分EDA對結(jié)腸癌生物學特性的影響及作用機制;
　　2、驗證EDA相關(guān)脂代謝基因CGI-58在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中作用及分子機制;
　　3、驗證CGI-58在惡

8、性黑色素瘤侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及分子機制;
　　4、揭示 CGI-58作為抑癌基因的功能,進一步闡釋腫瘤微環(huán)境與腫瘤代謝之間相互調(diào)控促進腫瘤惡性表型的作用及具體機制。
　　材料與方法:
　　1、腫瘤組織芯片免疫組化染色用于臨床病理特征相關(guān)性分析;
　　2、慢病毒載體建立EDA及CGI-58敲低及過表達的細胞模型用于研究EDA和CGI-58功能;
　　3、 CGI-58腸道特異性敲除APCmin/+小鼠用于研究腸

9、道腫瘤發(fā)生發(fā)展。
　　結(jié)果:
　　1、EDA在結(jié)腸癌及鼻咽癌中發(fā)揮促癌作用。
　　EDA通過維持CD133+/CD44+結(jié)腸癌亞群細胞的特性促進結(jié)腸癌惡性表型, Integrin/FAK/ERK信號途徑介導的Wnt/β-catenin通路激活是EDA促進結(jié)腸癌“干性”特征的重要分子機制。結(jié)腸癌細胞分泌型EDA通過與淋巴管內(nèi)皮細胞整合素受體Integrinα9相互作用促進出芽誘導因子Prox1的表達和細胞微絲蛋白的極性排

10、列,顯著促進淋巴管內(nèi)皮細胞的遷移、出芽和成管。血管內(nèi)皮細胞分泌型EDA通過誘導結(jié)腸癌細胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進結(jié)腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移,FAK/Src/Snail信號途徑介導了血管內(nèi)皮細胞分泌型EDA與結(jié)腸癌細胞表面integrinα9β1受體相互作用促進細胞EMT和侵襲轉(zhuǎn)移的效應。此外,鼻咽癌組織中EDA促進細胞放射抵抗,FAK/Akt/JNK信號途徑介導了EDA對鼻咽癌放療敏感性的影響。此外,我們的研究還表明,EDA可顯著調(diào)控脂代謝相關(guān)基因

11、CGI-58的表達。利用基因芯片對EDA過表達和對照細胞進行比較篩查發(fā)現(xiàn),EDA過表達細胞中葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白GLUT1及多種糖酵解關(guān)鍵酶顯著上調(diào),而脂代謝相關(guān)基因比較基因組學鑒定蛋白58(CGI-58)表達明顯收到抑制。Western blots檢測進一步驗證發(fā)現(xiàn),EDA過表達細胞中CGI-58蛋白表達水平顯著下降。
　　2、CGI-58缺失啟動代謝重編程誘導細胞惡變及發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化,進而促進結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展。
　　在結(jié)腸癌

12、組織中CGI-58的表達顯著低于癌旁組織和正常結(jié)腸組織,在結(jié)腸癌發(fā)生譜中,相比正常結(jié)腸粘膜組織,CGI-58的表達從炎癥到不典型增生無顯著變化,而在腺瘤中開始出現(xiàn)部分缺失,且缺失率與腺瘤癌變密切相關(guān)。通過將CGI-58腸道特異性敲除小鼠模型與結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展研究的經(jīng)典模型APCmin/+小鼠(腸道多發(fā)腺瘤小鼠模型)進行雜交發(fā)現(xiàn),腸道特異性CGI-58敲除的APCmin/+小鼠腸道腫瘤數(shù)量及體積較對照小鼠顯著增加,且腸道腺瘤發(fā)生明顯的惡性轉(zhuǎn)

13、化。體外實驗研究進一步證實,正常結(jié)腸粘膜上皮細胞CGI-58表達顯著高于結(jié)腸癌細胞,利用慢病毒載體敲低正常結(jié)腸粘膜上皮細胞中CGI-58表達后,細胞發(fā)生明顯的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT),侵襲能力顯著增強,且可在裸鼠體內(nèi)成瘤,而在結(jié)腸癌細胞中回復CGI-58的表達可顯著逆轉(zhuǎn)其成瘤及侵襲能力。進一步研究表明,CGI-58缺失的腸道上皮細胞中酯酶水解活性下降,胞內(nèi)出現(xiàn)大量中性脂質(zhì)沉積,脂肪酸線粒體氧化明顯受到抑制,同時細胞對葡萄糖的攝取明顯增加

14、,糖酵解關(guān)鍵酶表達上調(diào),且糖酵解中間產(chǎn)物明顯堆積。我們的研究還發(fā)現(xiàn),CGI-58敲低的細胞內(nèi)AMPK/p53活性受到抑制,而PI3K/Akt/mTOR信號通路被顯著激活,細胞自噬水平降低。結(jié)腸癌臨床標本研究進一步證實,CGI-58在結(jié)腸癌中的缺失與結(jié)腸癌的分期分級、轉(zhuǎn)移及復發(fā)率呈顯著正相關(guān),與結(jié)腸癌患者的預后呈負相關(guān)。
　　3. GI-58缺失誘導YAP/TAZ核轉(zhuǎn)位激活Wnt信號通路。
　　Wnt通路的激活與結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展

15、密切相關(guān),CGI-58缺失的結(jié)腸癌細胞Wnt通路靶基因c-MET表達顯著上調(diào),提示W(wǎng)nt通路被顯著激活。CGI-58缺失細胞中β-catenin表達略有下降,且核轉(zhuǎn)位并無明顯增強,提示CGI-58通過非β-catenin途徑激活了Wnt通路。進一步研究發(fā)現(xiàn),CGI-58敲低細胞中TAZ表達增強,YAP/TAZ復合物磷酸化顯著降低,核轉(zhuǎn)位明顯,且其共激活轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子TEAD活性顯著上調(diào),提示YAP/TAZ促轉(zhuǎn)錄活性增強。同時CGI-58腸

16、道敲除小鼠模型研究結(jié)果也證實,CGI-58敲除小鼠腸道腫瘤中TAZ表達增強,且YAP/TAZ核轉(zhuǎn)位明顯強于對照組。免疫熒光及免疫共沉淀證實CGI-58與YAP/TAZ并無直接結(jié)合,而脂滴相關(guān)蛋白ADRP與YAP/TAZ之間有共定位及結(jié)合,提示CGI-58通過蛋白-蛋白相互作用促進YAP/TAZ復合物去磷酸化而發(fā)生核轉(zhuǎn)位,進而通過增強共激活轉(zhuǎn)錄因子TEAD轉(zhuǎn)錄活性,上調(diào)Wnt靶基因c-MET表達,促進細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和侵襲轉(zhuǎn)移。

17、　　4. CGI-58缺失誘導黑色素瘤細胞去分化而促進其侵襲轉(zhuǎn)移能力
　　CGI-58在惡性黑色素瘤腫瘤組織中的表達與黑色素瘤生物學特性顯著相關(guān)。高侵襲黑色素瘤細胞中CGI-58表達顯著低于低侵襲黑色素瘤細胞。在低侵襲力黑色素瘤細胞中敲低CGI-58表達顯著促進其侵襲轉(zhuǎn)移能力,同時細胞色素出現(xiàn)顯著丟失。代謝產(chǎn)物分析發(fā)現(xiàn)CGI-58敲低的黑色素瘤細胞中溶血磷脂酸(LPA)含量升高,且LPA受體表達顯著上調(diào),利用LPA受體阻斷劑可有效

18、逆轉(zhuǎn)CGI-58敲低引起的細胞侵襲轉(zhuǎn)移及去分化。進一步研究發(fā)現(xiàn),CGI-58敲低的黑色素瘤細胞中與細胞分化密切相關(guān)的Wnt5A表達顯著上調(diào),證實CGI-58引起的磷脂代謝重編程可誘導細胞去分化而促進黑色素細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力。
　　結(jié)論:
　　1、結(jié)腸癌微環(huán)境中,結(jié)腸癌細胞分泌型EDA和內(nèi)皮細胞分泌型EDA均顯著促進結(jié)腸癌的惡性表型。EDA/整合素信號途徑在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色,是結(jié)腸癌靶向治療的特異性潛在靶標;EDA在

19、鼻咽癌中的高表達顯著促進了鼻咽癌放療抵抗,因此阻斷EDA相關(guān)信號途徑是提高鼻咽癌放療敏感性的有效手段;EDA可能通過顯著調(diào)控代謝基因CGI-58的表達參與腫瘤代謝調(diào)控;
　　2、CGI-58缺失導致的細胞供能方式從線粒體氧化轉(zhuǎn)化為有氧糖酵解,可能是結(jié)腸癌糖酵解增強重要原因;結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展過程中CGI-58特異性的表達活性缺失啟動的結(jié)腸癌代謝重編程激活下游PI3K/Akt/mTOR促癌信號途徑,誘導細胞惡性轉(zhuǎn)化及促進細胞侵襲轉(zhuǎn)移,是

20、結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的重要分子機理。
　　4、CGI-58缺失導致Wnt信號通路顯著激活,但CGI-58缺失通過非經(jīng)典β-catenin途徑,而通過誘導YAP/TAZ復合物入核激活Wnt信號,進一步揭示了CGI-58缺失促進結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的重要分子機制;
　　5、CGI-58在黑色素瘤細胞中的缺失通過調(diào)控磷脂代謝誘導細胞去分化而促進其侵襲轉(zhuǎn)移能力,揭示了脂代謝重編程促進黑色素瘤侵襲轉(zhuǎn)移的作用和機制,首次揭示了脂代謝重編程在黑色素瘤