脂代謝相關基因CGI-58在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及調控機制研究.pdf

1、背景:
　　腫瘤的發(fā)生發(fā)展受到基因的不穩(wěn)定性及腫瘤微環(huán)境的雙重調控。許多證據已經表明腫瘤微環(huán)境在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用,但其作用機制仍不清楚。纖連蛋白是腫瘤微環(huán)境中重要的細胞外基質糖蛋白,存在不同的可變剪接變異體,其中EDA+FN特異性的高表達于多種惡性腫瘤,且與多種腫瘤的惡性表型相關,但EDA對腫瘤生物學特性的影響及其具體分子機制尚不清楚。
　　代謝是機體生命活動的基本特征,正常細胞向惡性細胞的轉化過程中發(fā)生多種

2、生物學特性的改變,其中代謝重編程是其最顯著的特征之一。近年來研究發(fā)現(xiàn),某些癌基因的激活或抑癌基因的失活可調控代謝穩(wěn)態(tài)發(fā)揮其促癌或抑癌作用,且某些代謝酶本身即可作為癌基因或抑癌基因參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。腫瘤有氧糖酵解是最早被發(fā)現(xiàn)和研究的腫瘤代謝重編程,即腫瘤細胞即使在有氧環(huán)境下,也主要以糖酵解而非產能效率更高的線粒體氧化磷酸化的方式供能(Warburg效應)。葡萄糖和脂肪酸代謝是能量的主要來源,既往關于腫瘤代謝的研究主要集中在糖代謝,近年來

3、的研究發(fā)現(xiàn),脂代謝異常也參與調控了多種腫瘤的惡性表型,但脂代謝在惡性腫瘤中的具體作用及機制仍知之甚少。結腸癌已被證實為糖酵解異常增強的腫瘤,而腫瘤組織中脂質的異常沉積也是其重要表型,但結腸癌中這種糖脂代謝紊亂的原因及機制尚不明確。研究證實,腫瘤微環(huán)境參與調控了腫瘤代謝的重編程,而腫瘤微環(huán)境成分EDA是否參與了對結腸癌代謝的調控仍有待于進一步探討。
　　本研究通過慢病毒載體建立EDA過表達及干擾表達的細胞模型,研究了EDA對結腸癌及

4、鼻咽癌生物學特性的影響及分子機制。同時,我們發(fā)現(xiàn)結腸癌中EDA的過表達可顯著抑制脂代謝相關基因CGI-58的表達活性,結腸癌中CGI-58呈現(xiàn)出特異性的表達缺失。既往研究表明,CGI-58是脂質分解的一個強有力的活化因子,其缺乏導致脂滴大量沉積,且CGI-58缺乏的小鼠對葡萄糖利用顯著增加。因此我們猜測,結腸癌中CGI-58缺乏是導致腫瘤組織中脂質異常沉積和糖酵解增強的重要原因。為進一步明確CGI-58在結腸癌生物學特性中的作用,我們通

5、過建立腸道CGI-58特異性敲除的ApcMin/+小鼠,CGI-58敲低和CGI-58過表達細胞,聯(lián)合人結腸癌組織標本,鑒定了CGI-58缺失在誘導代謝重編程促進結腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　Wnt通路的激活與結腸癌發(fā)生發(fā)展密切相關,CGI-58缺失導致Wnt通路的靶基因c-MET表達顯著上調,提示Wnt通路被激活。我們的研究表明,CGI-58敲低細胞及CGI-58敲除小鼠腸道腫瘤中激活Wnt通路的經典分子β-catenin的表達

6、及核轉位并無增加。因此,我們進一步探討了CGI-58缺失經非β-catenin依賴途徑誘導YAP/TAZ復合物核轉位,激活Wnt信號通路的分子機制。
　　為進一步探討CGI-58在其他惡性腫瘤中是否同樣具有抑癌基因功能,我們根據腫瘤突變基因數(shù)據庫COSMIC的統(tǒng)計發(fā)現(xiàn),CGI-58在神經來源腫瘤中也呈現(xiàn)顯著缺失。黑色素瘤是神經來源的具有高度侵襲性的惡性腫瘤,已有研究報道脂代謝相關基因MAGL可顯著促進黑色素瘤細胞的侵襲轉移能力,為

7、進一步明確CGI-58在其他惡性腫瘤中是否同樣具有抑癌基因作用,通過慢病毒載體建立的CGI-58敲低及過表達黑色素瘤細胞模型,結合黑色素瘤臨床腫瘤組織標本,我們繼而研究了CGI-58在黑色素瘤分化及侵襲轉移中的作用及機制。
　　目的:
　　1、闡明結腸癌微環(huán)境成分EDA對結腸癌生物學特性的影響及作用機制;
　　2、驗證EDA相關脂代謝基因CGI-58在結腸癌發(fā)生發(fā)展中作用及分子機制;
　　3、驗證CGI-58在惡

8、性黑色素瘤侵襲轉移中的作用及分子機制;
　　4、揭示 CGI-58作為抑癌基因的功能,進一步闡釋腫瘤微環(huán)境與腫瘤代謝之間相互調控促進腫瘤惡性表型的作用及具體機制。
　　材料與方法:
　　1、腫瘤組織芯片免疫組化染色用于臨床病理特征相關性分析;
　　2、慢病毒載體建立EDA及CGI-58敲低及過表達的細胞模型用于研究EDA和CGI-58功能;
　　3、 CGI-58腸道特異性敲除APCmin/+小鼠用于研究腸

9、道腫瘤發(fā)生發(fā)展。
　　結果:
　　1、EDA在結腸癌及鼻咽癌中發(fā)揮促癌作用。
　　EDA通過維持CD133+/CD44+結腸癌亞群細胞的特性促進結腸癌惡性表型, Integrin/FAK/ERK信號途徑介導的Wnt/β-catenin通路激活是EDA促進結腸癌“干性”特征的重要分子機制。結腸癌細胞分泌型EDA通過與淋巴管內皮細胞整合素受體Integrinα9相互作用促進出芽誘導因子Prox1的表達和細胞微絲蛋白的極性排

10、列,顯著促進淋巴管內皮細胞的遷移、出芽和成管。血管內皮細胞分泌型EDA通過誘導結腸癌細胞發(fā)生上皮-間質轉化促進結腸癌的侵襲轉移,FAK/Src/Snail信號途徑介導了血管內皮細胞分泌型EDA與結腸癌細胞表面integrinα9β1受體相互作用促進細胞EMT和侵襲轉移的效應。此外,鼻咽癌組織中EDA促進細胞放射抵抗,FAK/Akt/JNK信號途徑介導了EDA對鼻咽癌放療敏感性的影響。此外,我們的研究還表明,EDA可顯著調控脂代謝相關基因

11、CGI-58的表達。利用基因芯片對EDA過表達和對照細胞進行比較篩查發(fā)現(xiàn),EDA過表達細胞中葡萄糖轉運蛋白GLUT1及多種糖酵解關鍵酶顯著上調,而脂代謝相關基因比較基因組學鑒定蛋白58(CGI-58)表達明顯收到抑制。Western blots檢測進一步驗證發(fā)現(xiàn),EDA過表達細胞中CGI-58蛋白表達水平顯著下降。
　　2、CGI-58缺失啟動代謝重編程誘導細胞惡變及發(fā)生上皮-間質轉化,進而促進結腸癌發(fā)生發(fā)展。
　　在結腸癌

12、組織中CGI-58的表達顯著低于癌旁組織和正常結腸組織,在結腸癌發(fā)生譜中,相比正常結腸粘膜組織,CGI-58的表達從炎癥到不典型增生無顯著變化,而在腺瘤中開始出現(xiàn)部分缺失,且缺失率與腺瘤癌變密切相關。通過將CGI-58腸道特異性敲除小鼠模型與結腸癌發(fā)生發(fā)展研究的經典模型APCmin/+小鼠(腸道多發(fā)腺瘤小鼠模型)進行雜交發(fā)現(xiàn),腸道特異性CGI-58敲除的APCmin/+小鼠腸道腫瘤數(shù)量及體積較對照小鼠顯著增加,且腸道腺瘤發(fā)生明顯的惡性轉

13、化。體外實驗研究進一步證實,正常結腸粘膜上皮細胞CGI-58表達顯著高于結腸癌細胞,利用慢病毒載體敲低正常結腸粘膜上皮細胞中CGI-58表達后,細胞發(fā)生明顯的上皮-間質轉化(EMT),侵襲能力顯著增強,且可在裸鼠體內成瘤,而在結腸癌細胞中回復CGI-58的表達可顯著逆轉其成瘤及侵襲能力。進一步研究表明,CGI-58缺失的腸道上皮細胞中酯酶水解活性下降,胞內出現(xiàn)大量中性脂質沉積,脂肪酸線粒體氧化明顯受到抑制,同時細胞對葡萄糖的攝取明顯增加

14、,糖酵解關鍵酶表達上調,且糖酵解中間產物明顯堆積。我們的研究還發(fā)現(xiàn),CGI-58敲低的細胞內AMPK/p53活性受到抑制,而PI3K/Akt/mTOR信號通路被顯著激活,細胞自噬水平降低。結腸癌臨床標本研究進一步證實,CGI-58在結腸癌中的缺失與結腸癌的分期分級、轉移及復發(fā)率呈顯著正相關,與結腸癌患者的預后呈負相關。
　　3. GI-58缺失誘導YAP/TAZ核轉位激活Wnt信號通路。
　　Wnt通路的激活與結腸癌發(fā)生發(fā)展

15、密切相關,CGI-58缺失的結腸癌細胞Wnt通路靶基因c-MET表達顯著上調,提示Wnt通路被顯著激活。CGI-58缺失細胞中β-catenin表達略有下降,且核轉位并無明顯增強,提示CGI-58通過非β-catenin途徑激活了Wnt通路。進一步研究發(fā)現(xiàn),CGI-58敲低細胞中TAZ表達增強,YAP/TAZ復合物磷酸化顯著降低,核轉位明顯,且其共激活轉錄調節(jié)因子TEAD活性顯著上調,提示YAP/TAZ促轉錄活性增強。同時CGI-58腸

16、道敲除小鼠模型研究結果也證實,CGI-58敲除小鼠腸道腫瘤中TAZ表達增強,且YAP/TAZ核轉位明顯強于對照組。免疫熒光及免疫共沉淀證實CGI-58與YAP/TAZ并無直接結合,而脂滴相關蛋白ADRP與YAP/TAZ之間有共定位及結合,提示CGI-58通過蛋白-蛋白相互作用促進YAP/TAZ復合物去磷酸化而發(fā)生核轉位,進而通過增強共激活轉錄因子TEAD轉錄活性,上調Wnt靶基因c-MET表達,促進細胞上皮-間質轉化和侵襲轉移。

17、　　4. CGI-58缺失誘導黑色素瘤細胞去分化而促進其侵襲轉移能力
　　CGI-58在惡性黑色素瘤腫瘤組織中的表達與黑色素瘤生物學特性顯著相關。高侵襲黑色素瘤細胞中CGI-58表達顯著低于低侵襲黑色素瘤細胞。在低侵襲力黑色素瘤細胞中敲低CGI-58表達顯著促進其侵襲轉移能力,同時細胞色素出現(xiàn)顯著丟失。代謝產物分析發(fā)現(xiàn)CGI-58敲低的黑色素瘤細胞中溶血磷脂酸(LPA)含量升高,且LPA受體表達顯著上調,利用LPA受體阻斷劑可有效

18、逆轉CGI-58敲低引起的細胞侵襲轉移及去分化。進一步研究發(fā)現(xiàn),CGI-58敲低的黑色素瘤細胞中與細胞分化密切相關的Wnt5A表達顯著上調,證實CGI-58引起的磷脂代謝重編程可誘導細胞去分化而促進黑色素細胞侵襲轉移能力。
　　結論:
　　1、結腸癌微環(huán)境中,結腸癌細胞分泌型EDA和內皮細胞分泌型EDA均顯著促進結腸癌的惡性表型。EDA/整合素信號途徑在結腸癌發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色,是結腸癌靶向治療的特異性潛在靶標;EDA在

19、鼻咽癌中的高表達顯著促進了鼻咽癌放療抵抗,因此阻斷EDA相關信號途徑是提高鼻咽癌放療敏感性的有效手段;EDA可能通過顯著調控代謝基因CGI-58的表達參與腫瘤代謝調控;
　　2、CGI-58缺失導致的細胞供能方式從線粒體氧化轉化為有氧糖酵解,可能是結腸癌糖酵解增強重要原因;結腸癌發(fā)生發(fā)展過程中CGI-58特異性的表達活性缺失啟動的結腸癌代謝重編程激活下游PI3K/Akt/mTOR促癌信號途徑,誘導細胞惡性轉化及促進細胞侵襲轉移,是

20、結腸癌發(fā)生發(fā)展的重要分子機理。
　　4、CGI-58缺失導致Wnt信號通路顯著激活,但CGI-58缺失通過非經典β-catenin途徑,而通過誘導YAP/TAZ復合物入核激活Wnt信號,進一步揭示了CGI-58缺失促進結腸癌發(fā)生發(fā)展的重要分子機制;
　　5、CGI-58在黑色素瘤細胞中的缺失通過調控磷脂代謝誘導細胞去分化而促進其侵襲轉移能力,揭示了脂代謝重編程促進黑色素瘤侵襲轉移的作用和機制,首次揭示了脂代謝重編程在黑色素瘤