CGI-58對(duì)5-FU誘導(dǎo)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　研究CGI-58對(duì)5-FU誘導(dǎo)的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞凋亡的影響及其作用機(jī)制。
　　方法:
　　一、離體實(shí)驗(yàn)考察CGI-58抵抗5-FU對(duì)巨噬細(xì)胞的殺傷作用及機(jī)制
　　1.CGI-58缺失對(duì)5-FU誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞增殖能力的影響
　　為了研究CGI-58抵抗5-FU對(duì)巨噬細(xì)胞的殺傷作用，我們?cè)隗w外用CCK-8法檢測(cè)了5-FU處理PLKO與CGI-58-KD的細(xì)胞增殖活力。
　　2.CGI-58缺失

2、對(duì)5-FU誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞周期的影響
　　為了研究CGI-58抵抗5-FU對(duì)巨噬細(xì)胞的殺傷作用機(jī)制，我們首先在體外通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了5-FU處理的PLKO與CGI-58-KD的細(xì)胞周期，觀察不同處理?xiàng)l件下G1期的細(xì)胞比例。
　　3.CGI-58缺失對(duì)5-FU誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡的影響
　　為了研究CGI-58缺失5-FU誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡的影響，我們?cè)隗w外通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了5-FU處理的PLKO與CGI-58-KD的細(xì)

3、胞凋亡，并用Western Blot檢測(cè)了其凋亡蛋白(Cleaved Caspase-3)的表達(dá)水平。
　　4.CGI-58缺失對(duì)巨噬細(xì)胞線粒體功能的影響
　　為了進(jìn)一步研究CGI-58抵抗5-FU對(duì)巨噬細(xì)胞的殺傷作用機(jī)制，我們又在體外對(duì)PLKO與CGI-58-KD的線粒體功能進(jìn)行了檢測(cè)，通過Seahorse檢測(cè)了其基礎(chǔ)耗氧率OCR，生物發(fā)光法檢測(cè)了其ATP生成量，熒光法檢測(cè)了其活性氧ROS的生成情況。
　　5.清除R

4、OS后CGI-58缺失對(duì)巨噬細(xì)胞線粒體功能及5-FU誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞增殖和凋亡的影響
　　為了驗(yàn)證上述效應(yīng)機(jī)制我們用活性氧抑制劑NAC做了回復(fù)實(shí)驗(yàn)，NAC阻斷處理后在體外通過熒光法檢測(cè)了PLKO與CGI-58-KD的ROS的生成情況，CCK-8法檢測(cè)了5-FU處理的PLKO與CGI-58-KD的細(xì)胞增殖能力及Western Blot檢測(cè)了其凋亡蛋白(Cleaved Caspase-3)的表達(dá)水平。
　　二、在體實(shí)驗(yàn)考察腫瘤相關(guān)

5、巨噬細(xì)胞CGI-58對(duì)5-FU化療效果的抵抗作用
　　1.CGI-58轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建(TGCGI-58)
　　我們用Western Blot鑒定了CGI-58過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠(TGCGI-58)和野生型小鼠(WT)腹腔原代巨噬細(xì)胞及其他組織器官的CGI-58的表達(dá)水平。
　　2.移植瘤（黑色素瘤）型中，去除巨噬細(xì)胞后5-FU對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠(TGCGI-58)和野生型小鼠(WT)腫瘤預(yù)后的影響
　　在體內(nèi)給轉(zhuǎn)基因

6、小鼠（TGCGI-58）和野生型小鼠(WT)皮下接種黑色素瘤后給予5-FU和巨噬細(xì)胞去除劑（氯膦酸二鈉脂質(zhì)體）處理，動(dòng)態(tài)檢測(cè)小鼠的體重和生存期。
　　3.移植瘤（黑色素瘤）模型中，5-FU對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠(TGCGI-58)和野生型小鼠(WT)腫瘤生長(zhǎng)和預(yù)后的影響
　　在體內(nèi)給轉(zhuǎn)基因小鼠（TGCGI-58）和野生型小鼠(WT)皮下接種黑色素瘤后給予5-FU化療，動(dòng)態(tài)檢測(cè)小鼠的體重、腫瘤生長(zhǎng)情況及生存期。
　　4.移植瘤（黑

7、色素瘤）模型中，清除ROS后5-FU對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠（TGCGI-58）和野生型小鼠(WT)的腫瘤生長(zhǎng)和預(yù)后的影響
　　用活性氧抑制劑NAC阻斷處理后在體內(nèi)通過皮下移植瘤（黑色素瘤）實(shí)驗(yàn)動(dòng)態(tài)檢測(cè)5-FU化療后轉(zhuǎn)基因（TGCGI-58）小鼠和野生型(WT)小鼠的體重、腫瘤生長(zhǎng)情況及生存期。
　　結(jié)果:
　?。ㄒ唬╇x體實(shí)驗(yàn)考察CGI-58抵抗5-FU對(duì)巨噬細(xì)胞的殺傷作用及機(jī)制
　　1.CGI-58缺失對(duì)5-FU誘導(dǎo)的巨噬

8、細(xì)胞增殖能力的影響
　　5-FU處理后，CGI-58-KD比PLKO細(xì)胞的增殖能力明顯降低，說明CGI-58缺失會(huì)促進(jìn)5-FU對(duì)巨噬細(xì)胞增殖活力的抑制作用。
　　2.CGI-58缺失對(duì)5-FU誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞周期的影響
　　5-FU處理后CGI-58-KD與PLKO細(xì)胞的G1期細(xì)胞比例無明顯差異，說明CGI-58缺失對(duì)5-FU誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞周期阻滯無顯著影響。
　　3.CGI-58缺失對(duì)5-FU誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡的

9、影響
　　5-FU處理后，CGI-58-KD比PLKO的凋亡細(xì)胞的比例明顯增加，且凋亡蛋白Caspase-3的表達(dá)水平明顯升高，說明CGI-58缺失會(huì)促進(jìn)5-FU誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡。
　　4.CGI-58缺失對(duì)巨噬細(xì)胞線粒體功能的影響
　　與PLKO相比，CGI-58-KD細(xì)胞的OCR降低、ATP減少、ROS增多，揭示CGI-58缺失會(huì)損傷巨噬細(xì)胞的線粒體功能，導(dǎo)致ROS聚集。
　　5.清除ROS后CGI-58缺

10、失對(duì)巨噬細(xì)胞線粒體功能及5-FU誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞增殖和凋亡的影響
　　ROS抑制劑NAC阻斷后，CGI-58-KD與PLKO細(xì)胞的ROS生成基本一致，5-FU處理的CGI-58-KD與PLKO細(xì)胞的增殖能力無明顯差異，且凋亡蛋白Caspase-3的表達(dá)水平也無差異，說明清除活性氧(ROS)可消除CGI-58缺失對(duì)巨噬細(xì)胞線粒體功能的損傷和CGI-58缺失促進(jìn)5-FU對(duì)巨噬細(xì)胞增殖活力的抑制作用以及CGI-58缺失對(duì)5-FU誘導(dǎo)的巨噬

11、細(xì)胞凋亡增加，綜上提示我們清除ROS后CGI-58缺失促進(jìn)5-FU對(duì)巨噬細(xì)胞殺傷活性的效應(yīng)消失
　?。ǘ┰隗w實(shí)驗(yàn)考察腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞CGI-58對(duì)5-FU化療效果的抵抗作用
　　1.CGI-58轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建（TGCGI-58）
　　只在腹腔原代巨噬細(xì)胞中轉(zhuǎn)基因小鼠(TGCGI-58)的CGI-58的表達(dá)水平明顯高于野生型小鼠(WT)，說明轉(zhuǎn)基因小鼠（TGCGI-58）構(gòu)建成功。
　　2.移植瘤（黑色素瘤）型

12、中，去除巨噬細(xì)胞后5-FU對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠(TGCGI-58)和野生型小鼠(WT)腫瘤預(yù)后的影響
　　將巨噬細(xì)胞去除后5-FU處理的轉(zhuǎn)基因小鼠(TGCGI-58)與野生型小鼠(WT)的體重和生存期均無明顯差異，說明轉(zhuǎn)基因小鼠(TGCGI-58)較之野生型小鼠(WT)，5-FU化療預(yù)后差，但是巨噬細(xì)胞去除后，可消除這種差異，且預(yù)后變好，提示TAM抵抗5-FU對(duì)腫瘤的化療效果，使預(yù)后變差。
　　3.移植瘤（黑色素瘤）模型中，5-FU

13、對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠(TGCGI-58)和野生型小鼠(WT)腫瘤生長(zhǎng)和預(yù)后的影響
　　5-FU處理后轉(zhuǎn)基因(TGCGI-58)小鼠比野生型(WT)小鼠的體重輕、腫瘤生長(zhǎng)快，生存期變短，說明巨噬細(xì)胞CGI-58過表達(dá)會(huì)抵抗5-FU對(duì)腫瘤的殺傷作用，預(yù)后變差。
　　4.移植瘤（黑色素瘤）模型中，清除ROS后5-FU對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠(TGCGI-58)和野生型小鼠(WT)的腫瘤生長(zhǎng)和預(yù)后的影響
　　ROS抑制劑NAC阻斷后，5-FU處理

14、的轉(zhuǎn)基因小鼠(TGCGI-58)與野生型小鼠(WT)的體重、腫瘤生長(zhǎng)情況和生存期也無明顯差異，并且均比轉(zhuǎn)基因小鼠(TGCGI-58)+5-FU組的預(yù)后更差，這說明轉(zhuǎn)基因（TGCGI-58）小鼠較之野生型(WT)小鼠，5-FU化療預(yù)后差，而清除活性氧(ROS)，不但可以消除上述這種差異而且巨噬細(xì)胞CGI-58過表達(dá)抵抗5-FU殺傷腫瘤的效應(yīng)也增強(qiáng)。
　　結(jié)論:
　　1.CGI-58缺失促進(jìn)5-FU對(duì)巨噬細(xì)胞的殺傷作用，而CGI