NO供體藥物JS-K在新建HBV感染細胞模型中的抗病毒效應初探.pdf

1、目的：建立NTCP過表達的HBV感染細胞模型，利用該模型探討NO供體藥物JS-K的抗病毒效應。
　　方法：⑴?；悄懰徕c共轉運多肽（NTCP)慢病毒載體構建及NTCP-SK-Hep1穩(wěn)轉細胞系的建立：構建NTCP慢病毒重組質粒Gv-NTCP，挑取克隆進行PCR擴增和序列測定；將陽性重組質粒Gv-NTCP與慢病毒輔助質粒共轉染人胚腎HEK293T細胞，包裝Gv-NTCP慢病毒、測定其滴度；Gv-NTCP慢病毒感染人肝癌細胞株SK-He

2、p1，嘌呤霉素篩選，通過熒光顯微鏡，實時熒光定量PCR和蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測NTCP的表達；⑵構建HBV陽性血清感染NTCP-SK-Hep1細胞模型：二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide， DMSO）、地塞米松預處理NTCP-SK-Hep1細胞系2d，HBV陽性血清、4％聚乙二醇8000（PEG）共孵育NTCP-SK-Hep1細胞系16 h，建立HBV感染細胞模型，設NC-SK-Hep1細胞系為對照

3、組進行感染實驗，通過酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）及熒光探針定量PCR技術驗證細胞模型是否構建成功；⑶JS-K抗HBV的效應初探：不同濃度的JS-K作用于HBV感染細胞模型，設病毒對照組及恩替卡韋（Entecavir，ETV）陽性藥物對照組，采用四甲基偶氮唑鹽（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl Tetrazolium b

4、romide，MTT）比色法、ELISA、熒光探針定量PCR技術檢測JS-K對細胞的增殖抑制作用及對細胞上清中的乙肝病毒表面抗原（Hepatitis B surface Agent，HBsAg）、乙肝病毒e抗原（Hepatitis B e Agent， HBeAg）及HBV DNA含量的影響。
　　結果：①NTCP慢病毒載體構建及NTCP-SK-Hep1穩(wěn)轉細胞系的建立：測序結果證實Gv-NTCP慢病毒載體構建成功；在HEK293

5、T細胞中包裝的Gv-NTCP重組慢病毒滴度為2.0×108 TU/mL；Gv-NTCP重組慢病毒感染SK-Hep1細胞后，在熒光顯微鏡下可見感染細胞表達綠色熒光，PCR及凝膠結果顯示感染組的NTCP表達明顯增高（P<0.05），Western blot結果顯示感染組的NTCP蛋白表達明顯增高（P<0.05），表明NTCP-SK-Hep1細胞構建成功；②HBV陽性血清感染NTCP-SK-Hep1細胞模型的構建：NTCP-SK-Hep1細胞

6、系及NC-SK-Hep1細胞株經過預處理后進行HBV感染，感染后第2天到第6天，細胞能夠持續(xù)分泌HBsAg及HBeAg，細胞上清中也能夠持續(xù)檢測到HBV DNA，且NTCP-SK-Hep1組的表達水平均明顯高于NC-SK-Hep1組（P<0.05），檢出時間也長于后者。③JS-K抗HBV的效應初探：MTT結果顯示JS-K在小于10μM的濃度范圍內對HBV感染的NTCP-SK-Hep1細胞無增殖抑制作用， JS-K的IC50為60.6μM