體外研究miR-155在HBV慢性感染中的抗病毒免疫作用.pdf

1、目的:
　　研究miR-155在HBV慢性感染的細胞模型中對免疫應答的調節(jié)及其抗HBV作用。
　　方法:
　　1.提取人肝癌細胞株總DNA作為模板，通過PCR擴增miR-155前體序列，酶切后退火連接到pmR-mCherry質粒，構建pmiR-155真核表達載體，然后進行菌落PCR、質粒雙酶切和DNA測序鑒定。
　　2.利用脂質體法將pmiR-155真核表達質粒轉染到HepG2.2.15細胞，同時設空載組（pmR

2、-mCherry質粒）、轉染試劑組、空白組和對照組（HepG2細胞）。轉染后24 h熒光顯微鏡下觀察細胞內紅色熒光蛋白的表達情況，熒光實時定量PCR檢測各組細胞內miR-155表達量。
　　3.重組質粒pmiR-155經去內毒素提取后，轉染到人肝癌細胞株。收集轉染后各組細胞及細胞培養(yǎng)上清液，應用RT-PCR檢測各組SOCS-1 mRNA的變化，Western Blot檢測各組SOCS-1蛋白的變化，ELISA檢測各組細胞的IFN-

3、γ及IL-2的分泌量變化。
　　4.重組質粒pmiR-155轉染到HepG2.2.15細胞，同時設空載組(pmR-mCherry質粒)、轉染試劑組、空白組。轉染后24h、48h、72h，應用熒光實時定量PCR檢測各組細胞內miR-155表達量，化學發(fā)光法定量檢測細胞培養(yǎng)上清液HBsAg和HBeAg變化，熒光實時定量PCR定量檢測HBV DNA拷貝數的變化。
　　結果:
　　1.通過菌落PCR、質粒雙酶切及DNA測序鑒定

4、，證實miR-155前體序列成功插入pmR-mcherry真核表達載體，pmiR-155真核表達載體構建成功。
　　2.轉染后24h、48h、72h各組細胞進行熒光觀察，載體中紅色熒光蛋白有較好的表達，轉染效率達到50％以上。熒光實時定量PCR結果表明，以空白組為基準，重組載體組細胞內所表達的miR-155明顯增加，具有顯著意義(P＜0.05)。
　　3.RT-PCR結果示:重組載體組SOCS-1 mRNA的表達量(0.63

5、±0.09)顯著低于空白組(P＜0.05);Western Blot結果示:重組載體組內SOCS-1蛋白表達量(0.37±0.07)顯著低于空白組(P＜0.05);ELISA結果示:以空白組為基準，重組載體組與對照組所分泌的IFN-γ、IL-2水平均顯著高于空白組(P＜0.05)，而空載組及轉染試劑組與空白組相似。
　　4.化學發(fā)光法結果示:以空白組為基準，轉染后重組載體組細胞所分泌HBsAg、HBeAg明顯減少，而空載組及轉染試

6、劑組與空白組相似。轉染后48h重組載體細胞內miR-155對HBsAg和HBeAg抑制最為明顯，抑制率分別為(83.96±1.52)％和(79.60±8.71)％。熒光實時定量PCR檢測結果示:轉染后24h、48h、72h，以空白組為基準，重組載體組中HBV DNA拷貝數明顯減少，而空載組及轉染試劑組未見明顯差異。其中重組載體組內miR-155對HBV DNA的抑制率分別為(51.87±0.36)％、(43.67±1.51)％和(68.