豬鏈球菌2型精氨酸脫亞氨酶基因的克隆表達(dá)及活性分析.pdf

1、根據(jù)GenBank登錄的精氨酸脫亞氨酶(arginine deiminase，AD)序列AF546864，設(shè)計(jì)并合成一對(duì)引物，對(duì)包括豬鏈球菌2型的36株鏈球菌ad進(jìn)行PcR檢測，29株豬鏈球菌均能檢出此基因，7株馬鏈球菌獸疫亞種均未檢出。對(duì)HA9801株、ZY05719、T15的ad片斷進(jìn)行測序，經(jīng)BLAST比對(duì)和DNAStar軟件分析，發(fā)現(xiàn)3株菌的ad序列與已發(fā)表的豬鏈球菌2型19841/1株的ad序列同源性高達(dá)99％，與化膿鏈球菌的

2、sagp和plr基因同源性分別為89％和88％。ad在豬鏈球菌中廣泛存在，且同源性較高。 對(duì)豬鏈球菌2型強(qiáng)毒株HA9801的ad進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并將此基因片斷定向克隆至嚴(yán)緊型表達(dá)質(zhì)粒pBAD/Myc-Hisc中，利用大腸桿菌ToP10成功表達(dá)了約47kD的AD融合蛋白，并經(jīng)鎳柱親和層析，獲得純化的重組酶。活性分析顯示，該酶具有巰基酶和金屬酶的特征，其最適反應(yīng)溫度為37℃，最適pH值為6.5。Western blot分析顯示，該

3、酶能與SS2-HA9801全菌蛋白制備的兔抗血清發(fā)生特異性反應(yīng)，表明其具有一定的免疫原性。檢測該酶有助于進(jìn)一步分析豬鏈球菌可能的毒力因子。 同一菌株在不同生長時(shí)期、不同生理狀態(tài)或者環(huán)境壓力下，其蛋白質(zhì)的表達(dá)水平會(huì)發(fā)生變化，這種變化可能與細(xì)菌的致病力有某些聯(lián)系?；谏鲜黾僭O(shè)，改變豬鏈球菌2型強(qiáng)毒株HA9801的培養(yǎng)溫度(從37℃升高到42℃)，分別提取菌株在不同生長條件下的膜蛋白，進(jìn)行二維電泳和免疫轉(zhuǎn)印，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其部分蛋白的表達(dá)