腸淋巴液致休克大鼠多器官損傷的作用及機(jī)制研究.pdf

1、失血性休克(hemorrhagicshock)是臨床常見(jiàn)急癥，在失血性休克的發(fā)展過(guò)程中，會(huì)引起腸道屏障功能障礙和腸內(nèi)細(xì)菌/內(nèi)毒素移位(bacteria/endotoxintranslocation，BET)，導(dǎo)致腸源性感染，進(jìn)而引起肺、肝、心、腎等多個(gè)器官的功能改變，誘發(fā)多器官功能障礙綜合征(multipleorgandysfunctionsyndrome，MODS)，嚴(yán)重威脅著人類生命，常常導(dǎo)致病人死亡。失血性休克致器官損傷的發(fā)生機(jī)制

2、可能與休克引起失控的全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemicinflammatoryresponsesyndrome，SIRS)以及腸源性內(nèi)毒素血癥等環(huán)節(jié)有關(guān)。淋巴學(xué)是循環(huán)系統(tǒng)研究的薄弱領(lǐng)域，長(zhǎng)期以來(lái)，一直認(rèn)為淋巴途徑是血液循環(huán)回流的輔助部分。作者多年的研究工作發(fā)現(xiàn)，淋巴微循環(huán)與休克的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸關(guān)系密切，結(jié)扎腸系膜淋巴管阻斷腸淋巴液回流，可減輕二次打擊大鼠的器官功能障礙，降低炎癥反應(yīng). 目的本研究通過(guò)整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，觀察腸系膜淋

3、巴管結(jié)扎阻斷淋巴回流對(duì)失血性休克大鼠多器官的損傷作用，從器官形態(tài)、功能及自由基(FR)、一氧化氮(NO)、腫瘤壞死因子(TNFα)、白介素-6(IL-6)的變化，探討其發(fā)病學(xué)機(jī)制；同時(shí)建立大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(pulmonarymicro-vascularendothelialcells，PMVEC)的原代培養(yǎng)技術(shù)，在離體條件下研究休克淋巴液對(duì)PMVEC的損傷作用，觀察休克淋巴液對(duì)PMVEC的形態(tài)、代謝活力、增殖與凋亡、凋亡相關(guān)基因及炎

4、癥介質(zhì)基因表達(dá)的影響，闡明休克淋巴液對(duì)多器官損傷的細(xì)胞分子機(jī)制，進(jìn)一步揭示腸淋巴液回流在休克發(fā)病學(xué)中的作用及意義。 方法1)大鼠重癥失血性休克模型的復(fù)制大鼠肌注2％的戊巴比妥鈉(50mg/kg)全身麻醉，無(wú)菌手術(shù)，行右側(cè)頸總動(dòng)脈和左側(cè)頸靜脈插管，舌靜脈注射0.5％肝素(1ml/kg)，全身抗凝。 2)存活率觀察30只Wistar雄性大鼠，均分為假手術(shù)組、休克組、結(jié)扎組3組(均n=10)。休克組及結(jié)扎組按“方法1)”復(fù)制失

5、血性休克模型。輸液復(fù)蘇后行腹部手術(shù)，結(jié)扎組行腸系膜淋巴管結(jié)扎術(shù)；休克組及假手術(shù)組僅在腸系膜淋巴管下穿線，不結(jié)扎。 3)器官功能及形態(tài)學(xué)觀察18只Wistar雄性大鼠，分為假手術(shù)組、休克組、結(jié)扎組3組(均n=6)，用于器官功能及形態(tài)學(xué)觀察。按“方法1)、2)”復(fù)制失血性休克模型，3組動(dòng)物分別于休克輸液復(fù)蘇后(或相當(dāng))6h，再次麻醉，頸總動(dòng)脈插管，放血，制備血清。全自動(dòng)血?dú)馑釅A分析儀檢測(cè)動(dòng)脈血pH、PaO2、PaCO2等反映肺功能的

6、指標(biāo)； 4)組織勻漿制備及炎癥介質(zhì)檢測(cè)78只大鼠分為假手術(shù)組、休克組、結(jié)扎組，用于不同時(shí)間點(diǎn)的組織勻漿制備及炎癥介質(zhì)檢測(cè)。按“方法1)、2)”復(fù)制失血性休克模型，休克組于維持低血壓90min后、輸液復(fù)蘇后0h，休克組及結(jié)扎組于輸液復(fù)蘇后1h、3h、6h、12h、24h等時(shí)間點(diǎn)(各時(shí)間點(diǎn)n=6)，假手術(shù)組于完成假手術(shù)后，分別處死動(dòng)物。 5)PMVEC的原代培養(yǎng)70～100g的Wistar雄性大鼠，戊巴比妥鈉全身麻醉后，75

7、％的酒精浸泡消毒。開(kāi)胸取出肺臟，置入預(yù)冷的Hank's液中，除去殘留血液，小心將肺的邊緣組織剪成1mm3大小的組3織小塊，貼入無(wú)菌的培養(yǎng)瓶中，經(jīng)培養(yǎng)箱固化2h后，加入DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行PMVEC的原代培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合后，經(jīng)胰蛋白酶消化后進(jìn)行傳代培養(yǎng)，應(yīng)用第三代PMVEC進(jìn)行本研究。 6)休克淋巴液的引流復(fù)制大鼠失血性休克模型，部分大鼠行腸系膜淋巴管插管，引流重癥休克期腸系膜淋巴液，時(shí)間為2h左右，量為0.5ml左右，離心取上清液

8、，儲(chǔ)存于-80℃冰箱內(nèi)備用；其它大鼠行門(mén)靜脈插管，制備休克門(mén)靜脈血漿。此外，應(yīng)用正常雄性大鼠同法腸系膜淋巴管插管或門(mén)靜脈插管，制備正常淋巴液及門(mén)靜脈血漿，作為對(duì)照。 7)PMVEC形態(tài)、增殖周期的觀察實(shí)驗(yàn)分為6組：A組(10％胎牛血清組)：培養(yǎng)液為DMEM+10％胎牛血清；B組(正常淋巴液組)：培養(yǎng)液為DMEM+正常淋巴液；C組(休克淋巴液組)：培養(yǎng)液為DMEM+休克淋巴液；D組(正常血漿組)：培養(yǎng)液為DMEM+正常血漿；E組(

9、休克血漿組)：培養(yǎng)液為DMEM+休克血漿；F組(無(wú)血清對(duì)照組)：培養(yǎng)液為DMEM。 8)休克淋巴液對(duì)PMVEC凋亡相關(guān)基因及炎癥介質(zhì)基因表達(dá)的影響4％終濃度的休克淋巴液與PMVEC孵育6h后，經(jīng)胰蛋白酶消化，制備細(xì)胞懸液。用UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒，一步法提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄出的cDNA，-20℃保存?zhèn)溆?。按AMV一步法RT-PCR試劑盒說(shuō)明，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，用β-actin作為內(nèi)參照，分別檢測(cè)PMVE

10、C的凋亡相關(guān)基因bcl-2、bax、Fas、FasL、炎癥介質(zhì)TNFα、IL-6、iNOS以及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)的mRNA表達(dá)；PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下拍照后進(jìn)行密度掃描，計(jì)算待測(cè)基因與β-actin的灰度值比表示待測(cè)基因的相對(duì)表達(dá)量。 9)休克淋巴液中內(nèi)毒素、TNFα、IL-6檢測(cè)24只Wistar雄性大鼠，按“方法1)”復(fù)制重癥失血

11、性休克模型，按“方法6)”進(jìn)行休克淋巴液、休克血漿、正常淋巴液、正常血漿的引流(均n=6)，封存于無(wú)熱原玻璃管中，4-80℃冷凍保存；采用改良的偶氮基質(zhì)顯色鱟試驗(yàn)(LAL)定量法檢測(cè)內(nèi)毒素水平。同時(shí)，另取部分引流的休克淋巴液、休克血漿、正常淋巴液、正常血漿按“方法3)”檢測(cè)TNFα、IL-6的含量。 結(jié)果1)24h存活率觀察，休克組大鼠顯著低于假手術(shù)組與結(jié)扎組(P＜0.05)。血?dú)夥治觯菘私M與假手術(shù)組、結(jié)扎組及實(shí)驗(yàn)前比較，動(dòng)脈

12、血pH、PaO2顯著降低、PaCO2明顯升高(P＜0.01，P＜0.05)；血清生化指標(biāo)檢測(cè)，休克組大鼠血清AST、ALT、BUN、Cre、LDH-1、CK-MB水平顯著高于實(shí)驗(yàn)前、假手術(shù)組和結(jié)扎組(P＜0.01)。 2)結(jié)扎腸系膜淋巴管阻斷淋巴液回流可減少器官組織勻漿促炎細(xì)胞因子及介質(zhì)的生成與釋放。失血性休克大鼠于輸液復(fù)蘇后不同時(shí)間點(diǎn)的肺、肝、心、腎勻漿的MDA、NO含量、NOS、MPO活性、TNFα、IL-6水平均顯著高于假

13、手術(shù)組，且SOD活性顯著低于假手術(shù)組(P＜0.01，P＜0.05)。結(jié)扎組大鼠于輸液復(fù)蘇行腸系膜淋巴管結(jié)扎阻斷腸淋巴液回流后，不同器官在不同時(shí)間點(diǎn)肺、肝、心、腎等重要器官組織勻漿的MDA、NO含量、NOS、MPO活性、TNFα、IL-6水平雖顯著高于假手術(shù)組，且SOD活性顯著低于假手術(shù)組(P＜0.01，P＜0.05)； 3)休克淋巴液對(duì)PMVEC具有損傷作用。以不同終濃度的休克淋巴液、休克血漿、正常淋巴液、正常血漿等與PMVEC

14、孵育后，隨著休克淋巴液濃度的增加以及作用時(shí)間的延長(zhǎng)，損傷作用逐漸增強(qiáng)，在一定范圍內(nèi)，呈時(shí)間、劑量效應(yīng)關(guān)系。4％的休克淋巴液作用PMVEC54h，部分細(xì)胞收縮、變圓，脫落細(xì)胞增加，10％終濃度的休克淋巴液作用12h全部細(xì)胞幾乎均破碎成片狀；休克血漿對(duì)PMVEC也有一定的損傷作用，但作用明顯弱于休克淋巴液。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示：4％休克淋巴液作用PMVEC4h后，出現(xiàn)亞二倍體凋亡峰，休克淋巴液誘導(dǎo)的凋亡的百分率為(35.2±1.4)％，明

15、顯高于其它各組(P＜0.01)；細(xì)胞周期分析顯示，G0/G1期細(xì)胞比值增大，S、G2/M期細(xì)胞比值下降。結(jié)果提示休克淋巴液的抑制大鼠PMVEC增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡、壞死的作用。 4)以4％終濃度的休克淋巴液、休克血漿與PMVEC孵育6h，與其它各組比較，促凋亡相關(guān)基因bax、Fas、FasL以及炎癥介質(zhì)TNFα、IL-6、iNOS的mRNA表達(dá)顯著增強(qiáng)，抑制凋亡基因bcl-2以及VEGF的mRNA表達(dá)顯著降低(P＜0.01，P＜0

16、.05)；而休克淋巴液組的bax、Fas、FasL、TNFα、IL-6、iNOS的mRNA表達(dá)顯著高于休克血漿組，且bcl-2、VEGF的mRNA表達(dá)顯著低于休克血漿組(P＜0.01)。對(duì)休克淋巴液、休克血漿、正常淋巴液、正常血漿毒性物質(zhì)檢測(cè)的結(jié)果顯示：休克淋巴液中內(nèi)毒素、TNFα、IL-6含量顯著高于休克血漿、正常淋巴液及正常血漿(P＜0.01)。結(jié)果提示，休克淋巴液對(duì)PMVEC的損傷作用與上調(diào)促炎介質(zhì)和促凋亡基因表達(dá)、下調(diào)抑凋亡基因

17、及VEGF表達(dá)以及休克淋巴液中高濃度的內(nèi)毒素、TNFα、IL-6有關(guān)。 結(jié)論1)結(jié)扎腸系膜淋巴管，阻斷休克大鼠的淋巴液回流，可提高失血性休克大鼠的存活率，改善器官功能及組織學(xué)損傷，其機(jī)制與減少腸源性內(nèi)毒素移位、降低自由基損傷、NO、TNFα、IL-6的釋放及表達(dá)、減少中性粒細(xì)胞扣押有關(guān)。 2)休克淋巴液具有損傷PMVEC的作用，且損傷作用顯著強(qiáng)于休克血漿，其機(jī)制與休克淋巴液誘導(dǎo)PMVEC凋亡、上調(diào)炎癥介質(zhì)TNFα、IL-