高植酸酶高蛋白二價營養(yǎng)飼料酵母工程菌構建及其發(fā)酵的初步研究.pdf

1、谷物和油料作物是食品和飼料的主要來源，其中無機磷的含量是衡量其營養(yǎng)價值高低的標準之一。在生物質(zhì)原料中，相當數(shù)量的一部分磷元素是以肌醇六磷酸磷酸鹽(又稱植酸鹽)的形式存在的。植酸鹽在營養(yǎng)學中被認為是一種抗營養(yǎng)因子，其表現(xiàn)為對無機鹽強烈的強螯合作用以及對蛋白的強絡合能力，最終導致多種營養(yǎng)元素不能被動物吸收利用，在很大程度上降低了食品和飼料的營養(yǎng)價值。植酸酶是可以催化植酸鹽脫掉磷酸基團反應的一種蛋白酶。在飼料中人為的補加外源植酸酶制劑，是解除

2、飼料中由植酸鹽引起的抗營養(yǎng)等消極作用，提高飼料營養(yǎng)價值的有效途徑，其缺點在于在提高飼料營養(yǎng)價值的同時也提高了飼料的成本。 釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是一種公認安全的微生物(GRAS)，具有較高的蛋白含量及其它營養(yǎng)成分而被廣泛應用于食品與飼料中。利用基因工程手段，改造具有較高蛋白含量的面包酵母，使其同時具有高植酸酶活性，成為二價營養(yǎng)飼料酵母，用于飼料或飼料添加劑，在實際生產(chǎn)應用中有著重要的意義。

3、 本文通過PCR擴增獲得黑曲霉的植酸酶基因phyA，將其連接于釀酒酵母多拷貝整合載體上，構建含有植酸酶基因的高拷貝釀酒酵母工業(yè)菌株重組表達質(zhì)粒(pYMIKP-phyA)。利用本實驗室已經(jīng)建立的釀酒酵母工業(yè)菌株轉(zhuǎn)化方法，將重組質(zhì)粒線性化后，轉(zhuǎn)化具有高蛋白含量的面包酵母工業(yè)菌株，獲得面包酵母重組工業(yè)菌株。提取轉(zhuǎn)化子的染色體，通過PCR擴增技術，證明了phyA基因在工業(yè)酵母基因組中的整合。染色體中整合入不同拷貝數(shù)G418抗性基因的轉(zhuǎn)化

4、子對培養(yǎng)基中的G418抗性不同，表現(xiàn)為在含有相同濃度G418的YEPD固體平板培養(yǎng)基上的生長情況有所不同。因此，利用G418抗性平板點滴試驗，篩選具有較高拷貝數(shù)的轉(zhuǎn)化子。經(jīng)過兩輪篩選后，獲得一株高表達植酸酶phyA基因的重組酵母菌株YP-6。YEPD培養(yǎng)基搖瓶發(fā)酵的酶活測定結果表明，重組酵母菌株YP-6表現(xiàn)出的表觀植酸酶比酶活可達55.61U／mg蛋白，較出發(fā)菌株提高了1.65倍。 將獲得的高蛋白高植酸酶活性的二價飼料營養(yǎng)酵母重

5、組菌株YP-6在飼料淀粉水解液培養(yǎng)基中進行發(fā)酵試驗，對其發(fā)酵性能進行初步研究。分析發(fā)酵固形產(chǎn)物中植酸酶的含量，并對發(fā)酵產(chǎn)物的后期處理方式做初步探索。結果表明，重組菌株YP-6在淀粉水解液培養(yǎng)基中經(jīng)過一段時間的生長，在菌體量達到頂峰過后很短的時間內(nèi)胞內(nèi)積累的植酸酶含量也達到頂峰。固形物中植酸酶含量最高可達2380U/g干物質(zhì)，與市售的單位為2500U/g的商品化植酸酶制劑活性相當，可用于飼料或輔料的生產(chǎn)。由于產(chǎn)生的植酸酶存在于胞內(nèi)，在儲藏