不同表型的酵母工程菌對(duì)植酸酶表達(dá)的影響.pdf

1、植酸酶是一類催化植酸及植酸鹽水解成肌醇和無(wú)機(jī)磷酸的酶，添加于食品和飼料中，可以提高磷的吸收利用率，提高食品和飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值；減少植酸對(duì)微量元素的螯合，消除植酸所引起的抗?fàn)I養(yǎng)作用；同時(shí)也減少了動(dòng)物糞便中植酸磷的含量，降低了磷對(duì)環(huán)境的污染，有利于保護(hù)環(huán)境等。因此，植酸酶的研究與應(yīng)用具有重大的理論和現(xiàn)實(shí)意義。 目前國(guó)內(nèi)外對(duì)植酸酶及其基因進(jìn)行了大量研究，構(gòu)建了表型為甲醇利用型和非甲醇利用型的酵母工程菌表達(dá)植酸酶。本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建了一株表

2、型為甲醇利用型的菌株，研究發(fā)現(xiàn)，重組植酸酶的表達(dá)量以及酶學(xué)性質(zhì)與出發(fā)菌表達(dá)的植酸酶相比具有較大的變化，特別是pH的適用范圍得到了較大的拓寬。試驗(yàn)通過(guò)原生質(zhì)體法把外源表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到畢赤酵母中，然后外源表達(dá)載體雙交換整合到畢赤酵母染色體上，獲得表型為非甲醇利用型的酵母工程菌來(lái)表達(dá)植酸酶，從而研究?jī)煞N表型的酵母工程菌對(duì)植酸酶表達(dá)的影響，為進(jìn)一步研究影響植酸酶基因在畢赤酵母中表達(dá)的因素奠定理論基礎(chǔ)；也為植酸酶的工業(yè)化生產(chǎn)提供更為優(yōu)良的菌株奠定基

3、礎(chǔ)。因此試驗(yàn)在實(shí)驗(yàn)室前期研究的基礎(chǔ)上，做了如下研究： 1．質(zhì)粒DNA的提取及線性化用質(zhì)粒少量制備試劑盒提取pPIC9K-phyA質(zhì)粒DNA，用Dra I酶酶切pPIC9K-phyA質(zhì)粒，電泳檢測(cè)表明已徹底酶切后，用酚/氯仿抽提，無(wú)水乙醇進(jìn)行沉淀回收，并用10μL TE溶解，經(jīng)紫外分光法檢測(cè)DNA濃度達(dá)500ng/μL。 2．畢赤酵母(GS115)原生質(zhì)體的制備及轉(zhuǎn)化用Zymolyase在高滲緩沖液中處理酵母細(xì)胞制備原

4、生質(zhì)體，在PEG和CaCl<,2>存在下與外源DNA溫育，將外源DNA導(dǎo)入原生質(zhì)體，再經(jīng)高滲選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行再生培養(yǎng)，在培養(yǎng)24小時(shí)后，平板上出現(xiàn)較多的小菌落，表明利用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化也可獲得較多轉(zhuǎn)化子。 3．轉(zhuǎn)化子的表型篩選和PCR鑒定于30℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，直至長(zhǎng)為大小適中的單菌落，在MM和MD平板上進(jìn)行表型篩選。在MD平板上生長(zhǎng)正常而在MM平板上生長(zhǎng)緩慢的初步鑒定為Mut<'S>型。提取初步鑒定為Mut<'S

5、>型轉(zhuǎn)化子的總DNA，用5’AOXI引物和3’AOXl引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物電泳出現(xiàn)一條約1.8kb的目的帶，表明此轉(zhuǎn)化子為Mut<'S>型，共獲得21個(gè)Mut<'S>型重組子。 4．Mut<'S>重組子和Mut<'+>重組子表達(dá)植酸酶的量以及酶學(xué)性質(zhì)比較。 (1)Mut<'+>重組子在誘導(dǎo)培養(yǎng)168小時(shí)之內(nèi)，植酸酶的表達(dá)量隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，到168小時(shí)接近高峰，最高酶活達(dá)到143958.3U/mL；Mut

6、<'S>重組子在誘導(dǎo)培養(yǎng)192小時(shí)之內(nèi)植酸酶的表達(dá)量隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，到192小時(shí)接近高峰，最高酶活達(dá)到141058.3U/mL。兩種表型工程菌株表達(dá)產(chǎn)物的分子量都介于70kDa～97kDa之間。 (2) 最適pH研究結(jié)果表明，兩種重組酵母表達(dá)的植酸酶最適作用pH值都有兩個(gè)(37℃條件下反應(yīng)1小時(shí))，分別為2.5～3.0和5.0～5.5，pH2.5與pH3.0峰值相當(dāng)，pH5.0與pH5.5峰值相當(dāng)，在pH4.5～6.5之間均有相當(dāng)高