毛蚶(Scapharca kagoshimensis)血紅蛋白的類(lèi)酚氧化酶活性及其cDNA克隆的研究.pdf

1、毛蚶(Scapharca kagoshimensis)是隸屬于軟體動(dòng)物門(mén)瓣鰓綱的一種具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的海洋無(wú)脊椎動(dòng)物，其缺乏真正意義上的抗體、沒(méi)有免疫記憶能力，只能依靠非特異性免疫反應(yīng)來(lái)抵御寄生蟲(chóng)和疾病，其中血細(xì)胞和免疫因子在其對(duì)多種病原微生物的免疫防御反應(yīng)中起著決定性作用。血紅蛋白(hemoglobin，Hb)是所有脊椎動(dòng)物和部分無(wú)脊椎動(dòng)物血液中所含有的一大類(lèi)含鐵的呼吸蛋白，除具有運(yùn)輸氧氣的主要功能外，還具有穩(wěn)定血壓、抗菌、運(yùn)輸硫化物

2、、調(diào)節(jié)酸堿平衡、氧化酶、過(guò)氧化酶活性等多種生物學(xué)功能，是最具有研究?jī)r(jià)值的蛋白質(zhì)家族之一。在其發(fā)現(xiàn)無(wú)脊椎動(dòng)物血藍(lán)蛋白具有類(lèi)酚氧化酶活性之后，本實(shí)驗(yàn)室首次發(fā)現(xiàn)毛蚶Hb也具有類(lèi)酚氧化酶活性，從此揭開(kāi)了毛蚶Hb非特異性免疫功能研究的序幕。本研究擬利用生物化學(xué)和分子生物學(xué)手段從其血淋巴中分離純化出毛蚶Hb，鑒定其類(lèi)酚氧化酶活性(PO-like activity)及其激活因子，確定其生物化學(xué)性質(zhì)和酶性質(zhì)，查清幾種常用免疫促進(jìn)劑刺激以及細(xì)菌感染對(duì)毛蚶

3、Hb與血細(xì)胞的影響作用，克隆出毛蚶Hb的全長(zhǎng)cDNA序列，并利用推測(cè)一級(jí)結(jié)構(gòu)氨基酸序列進(jìn)行初步的同源性分析，旨在證實(shí)毛蚶Hb的非特異性免疫功能，為揭示毛蚶血紅蛋白在動(dòng)物非特異性免疫中的作用及分子機(jī)理，鑒定其在呼吸蛋白家族中的分子進(jìn)化地位等奠定基礎(chǔ)。 本文利用Sephacryl S-100凝膠過(guò)濾柱層析和Q sepharose Fast Flow離子交換柱層析技術(shù)成功從毛蚶血淋巴中分離純化出了血紅蛋白，并以L(fǎng)-二羥苯丙氨酸(L-D

4、OPA)為特異性底物對(duì)其類(lèi)酚氧化酶活性進(jìn)行了鑒定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所得毛蚶Hb純化樣品在SDS-PAGE電泳中為分子量約14.27 kDa的單一條帶，膠內(nèi)酶切肽指紋圖譜分析結(jié)果證實(shí)所得純化樣品確為Hb；同時(shí)，所得毛蚶Hb純化樣品對(duì)L-DOPA具有很強(qiáng)的氧化活性，且Native-PAGE電泳條帶的L-DOPA染色結(jié)果也證實(shí)其具有很強(qiáng)的氧化活性，表明毛蚶Hb確實(shí)具有類(lèi)酚氧化酶活性。 生化性質(zhì)和酶性質(zhì)研究結(jié)果表明，毛蚶血紅蛋白純化樣品對(duì)

5、L-DOPA發(fā)揮類(lèi)酚氧化酶活性的最適pH值為7.0、最適反應(yīng)溫度為30℃，其Km值約為4.90mmol/L，且其類(lèi)酚氧化酶活性可為異丙醇所進(jìn)一步激活；不同氧化酶抑制劑的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，毛蚶Hb純化樣品的類(lèi)酚氧化酶活性對(duì)苯甲酸非常敏感，對(duì)抗壞血酸、亞硫酸鈉、檸檬酸和硫脲較為敏感，而對(duì)苯硫脲和半胱氨酸不敏感，表明毛蚶Hb發(fā)揮類(lèi)酚氧化酶活性是具有酪氨酸酶類(lèi)型的酚氧化酶性質(zhì)；此外，金屬離子螯合劑乙二胺四乙酸(EDTA)，Zn2+和Cu2+均能強(qiáng)烈

6、抑制毛蚶Hb純化樣品的類(lèi)酚氧化酶活性，二乙基二硫氨基甲酸酯(DETC)、Ca2+和Mg2+的抑制作用較小，而Fe2+卻具有激活作用，說(shuō)明毛蚶Hb的類(lèi)酚氧化酶活性還具有金屬酶性質(zhì)；毛蚶Hb純化樣品類(lèi)酚氧化酶活性的回復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，被EDTA抑制的類(lèi)酚氧化酶活性可特異性地為Fe2+所回復(fù)，進(jìn)一步證明其是一種含鐵金屬酶性質(zhì)。綜上所述，毛蚶Hb發(fā)揮類(lèi)酚氧化酶活性具有酪氨酸酶類(lèi)型的含鐵酚氧化酶的性質(zhì)。 免疫促進(jìn)劑處理毛蚶的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，脂

7、多糖、β-葡聚糖、滅活哈維氏弧菌和滅活鰻弧菌處理48 h后，與對(duì)照組相比，毛蚶Hb的產(chǎn)量分別增加了7.47％、6.17％、10.39％和27.92％，其類(lèi)酚氧化酶總活性分別增加了20.72％、4.03％、11.40％和45.84％，而單位酶活性沒(méi)有顯著差異，表明上述四種免疫促進(jìn)劑的刺激可不同程度地提高毛蚶Hb的合成量及其類(lèi)酚氧化酶總活性，其中以滅活鰻弧菌的刺激效果最為顯著；此外，脂多糖、β-葡聚糖、滅活哈維氏弧菌和滅活鰻弧菌處理48 h

8、后，毛蚶的血細(xì)胞的總數(shù)分別增加了8.3％、6.3％、2.0％和20.8％，表明上述四種免疫促進(jìn)劑的刺激可不同程度地增加毛蚶血細(xì)胞的數(shù)量，其中以滅活鰻弧菌的刺激效果最為顯著。綜上所述，免疫促進(jìn)劑脂多糖、β-葡聚糖、滅活哈維氏弧菌和滅活鰻弧菌可可不同程度地增加毛蚶血細(xì)胞的數(shù)量、提高毛蚶Hb的合成量及其類(lèi)酚氧化酶總活性，暗示血細(xì)胞和血紅蛋白的確參與了免疫促進(jìn)劑刺激下毛蚶自身免疫力的提高。 細(xì)菌感染毛蚶的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，1×107個(gè)/mL

9、，鰻弧菌感染毛蚶48h后，與對(duì)照組相比，毛蚶Hb的產(chǎn)量增加了19.78％，類(lèi)酚氧化酶總活性增加了5.29％，血細(xì)胞的總數(shù)卻減少了37.71％；1x108個(gè)/mL哈維氏弧菌感染毛蚶48h后，與對(duì)照組相比，毛蚶Hb的產(chǎn)量增加了8.44％，類(lèi)酚氧化酶總活性增加了6.36％，血細(xì)胞的總數(shù)卻減少了1.75％；而濃度為1×105個(gè)/mL的哈維氏弧菌和鰻弧菌感染48h后毛蚶Hb的產(chǎn)量減少了1.99％和7.94％，類(lèi)酚氧化酶總活性減少了1.15％和5.

10、59％，血細(xì)胞數(shù)量減少了35.63％和16.67％；上述結(jié)果表明，細(xì)菌感染能不同程度地引起毛蚶血細(xì)胞數(shù)量的減少，且高濃度細(xì)菌感染可不同程度地引起毛蚶Hb產(chǎn)量和類(lèi)酚氧化酶總活性的增加，但低濃度細(xì)菌感染反而會(huì)不同程度地引起毛蚶Hb產(chǎn)量和類(lèi)酚氧化酶總活性的降低，暗示血細(xì)胞和Hb的確參與了毛蚶的非特異性免疫反應(yīng)。 從毛蚶血細(xì)胞中提取總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)和快速擴(kuò)增cDNA末端(RACE)技術(shù)，分別克隆出了毛

11、蚶血紅蛋白HbⅠ、HbⅡ A和HbⅡ B的全長(zhǎng)cDNA序列，HbⅠ的cDNA全長(zhǎng)為756 bp，編碼147個(gè)氨基酸殘基，分子量為16.2 kDa，與不等殼毛蚶(Scapharca inaequivalvis)HbⅠ的同源性為99.32％；HbⅡ A的cDNA全長(zhǎng)為755 bp，編碼150個(gè)氨基酸殘基，分子量為16.5 kDa，與不等殼毛蚶(Scapharca inaequivalvis)HbⅡ-A鏈同源性為98.67％；HbⅡ B的cD