抗人CD25基因工程抗體和免疫毒素在畢赤酵母中的表達(dá).pdf

1、目的和意義：
　　CD25表達(dá)于活化T細(xì)胞表面，靜息T細(xì)胞不表達(dá)，這為靶向治療以活化T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病如T細(xì)胞淋巴瘤、自身免疫病、移植排斥反應(yīng)等提供了科學(xué)依據(jù)。
　　采用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，以Daclizumab（人源化抗CD25單抗隆抗體）為基礎(chǔ)，構(gòu)建重組表達(dá)載體pPICZalpha A-biscfv(Daclizumab)和pPICZalpha A-dmDT390-biscfv(Daclizumab)，在重組畢赤酵母GS11

2、5菌株中誘導(dǎo)表達(dá)biscfv(Daclizumab)和dmDT390-biscfv(Daclizumab)重組蛋白，為淋巴瘤、急性排斥反應(yīng)、自身免疫病等疾病提供新的藥物治療方案。
　　研究方法：
　　合成目的基因及構(gòu)建表達(dá)載體:利用DNAWorks軟件，獲得具有互補(bǔ)末端的寡核苷酸引物，采用裝配PCR法，合成四條短的基因片段scfv(1)、scfv(2)、scfv(3)、dmDT390并連接至pMD19-T載體，測(cè)序正確后，四

3、條短的基因片段酶切拼接后最終連入畢赤酵母表達(dá)載體pPICZalpha A。
　　采用畢赤酵母系統(tǒng)表達(dá)蛋白:線性化的表達(dá)載體通過氯化鋰轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)至畢赤酵母GS115，在含有博來霉素的YPDS平板中篩選陽(yáng)性克隆子。采用BMGY培養(yǎng)基增殖培養(yǎng)，BMMY培養(yǎng)基誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。
　　SDS-PAGE和Western blot:蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，采用鼠抗組氨酸尾抗體作為一抗，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG

4、抗體作為二抗，采用化學(xué)發(fā)光試劑盒觀察結(jié)果。
　　蛋白純化:采用鎳柱純化蛋白，純化出的蛋白采用高效液相色譜儀(HPLC)進(jìn)行分析。
　　結(jié)果：
　　1.通過DNAWorks軟件設(shè)計(jì)出合成scfv(1)、scfv(2)、scfv(3)的24條寡核苷酸引物，以及合成dmDT390的44條寡核苷酸引物，通過裝配PCR將合成的基因片段連入pMD19-T載體，測(cè)序獲得插入正確基因片段的pMD19-scfv(1)、pMD19-scf

5、v(2)、pMD19-scfv(3)和pMD19-dmDT390載體。pMD19-scfv(1)和pMD19-scfv(2)經(jīng)酶切拼接后最終連入pPICZalpha A載體形成了pPICZalpha A-biscfv表達(dá)載體;pMD19-scfv(2)、pMD19-scfv(3)和pMD19-dmDT390經(jīng)酶切拼接后最終連入pPICZalphaA載體形成了pPICZalpha A-dmDT390-biscfv表達(dá)載體。
　　2.

6、經(jīng)氯化鋰轉(zhuǎn)化法獲得了穩(wěn)定整合目的基因的畢赤酵母菌株。
　　3.整合了biscfv目的基因的畢赤酵母菌，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE（還原性）電泳分析，得到分子量約為55kd表達(dá)產(chǎn)物，western blot驗(yàn)證含組氨酸尾，為目的蛋白。
　　4.整合了dmDT390-biscfv目的基因的畢赤酵母菌，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE（非還原性）電泳分析，得到分子量約為95kd表達(dá)產(chǎn)物，western blot驗(yàn)證含組氨酸尾，為目的蛋白