畢赤酵母表達(dá)gp96-scFv抗體及生物活性測(cè)定.pdf

1、熱休克蛋白gp96（又稱作GRP94）是hsp90家族的一員，與細(xì)胞質(zhì)中的hsp90具有50％的同源性。它主要存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，也有一部分位于癌細(xì)胞的膜表面。與其它熱休克蛋白一樣，gp96的主要生物學(xué)功能是分子伴侶的功能，它參與蛋白的折疊、轉(zhuǎn)運(yùn)、降解及多聚體的組裝等。gp96可以特異性結(jié)合抗原肽，增強(qiáng)抗原呈遞的特性使其作為一種新型免疫佐劑被廣泛應(yīng)用于細(xì)菌及流感、人乳頭瘤病毒、艾滋病、乙型肝炎等病原感染的研究中。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)gp96在

2、腫瘤的發(fā)生發(fā)展中，腫瘤細(xì)胞的快速生長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致腫瘤缺氧、缺血及局部酸中毒，這些應(yīng)激條件刺激腫瘤組織表達(dá)產(chǎn)生包括gp96在內(nèi)的許多熱休克蛋白，熱休克蛋白可能作為分子伴侶來(lái)調(diào)節(jié)腫瘤的不斷增殖從而使腫瘤細(xì)胞克服各種不利的生理環(huán)境。并且gp96的表達(dá)與腫瘤的發(fā)生，發(fā)展及細(xì)胞分化呈現(xiàn)相關(guān)性。同樣gp96在一些致病菌包括病毒的入侵，胞內(nèi)擴(kuò)增等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。因此，獲得特異性結(jié)合gp96的抗體檢測(cè)gp96的表達(dá)，同時(shí)采用抗體靶向中和gp96來(lái)抑制與其

3、有關(guān)疾病如腫瘤的發(fā)生，都有很重要的意義。
　　目的:本文利用畢赤酵母分泌表達(dá)gp96-scFv抗體，純化后得到能特異性結(jié)合gp96抗原的小分子抗體片段(scFv)。方法:根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的gp96-scFv抗體基因序列，合成gp96-scFv抗體基因序列，將gp96-scFv抗體序列克隆到畢赤酵母表達(dá)質(zhì)粒pPICZα-A，線性化的重組表達(dá)載體電轉(zhuǎn)化到畢赤酵母X33，甲醇誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)，通過(guò)親和層析法純化目的蛋白，并以SDS-PAGE

4、和Western blot進(jìn)行鑒定。通過(guò)Western blot、Immunofluorescence、ELISA、FACS方法對(duì)gp96-scFv抗體的生物活性進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果:成功地構(gòu)建了分泌表達(dá)抗gp96蛋白scFv抗體的畢赤酵母菌，每升畢赤酵母菌培養(yǎng)上清經(jīng)純化可獲約50mg gp96-scFv抗體，所獲抗體其分子量大約為15kDa。具有與gp96抗原特異性結(jié)合的活性。結(jié)論:本研究利用畢赤酵母菌成功表達(dá)了重組gp96-scFv抗體