IHHNV編碼蛋白的原核表達(dá)、多克隆抗體制備及編碼蛋白間相互作用研究.pdf

1、傳染性皮下及造血組織壞死病毒（Infection hypodermal and hematopoietic necrosis virus，IHHNV）是感染對蝦的一種重要病原。然而，目前國內(nèi)外對其展開的研究主要集中在分子流行病學(xué)、病理學(xué)及檢測技術(shù)上，而對編碼蛋白的相關(guān)基礎(chǔ)研究鮮有報(bào)道。主要對其編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白1（Nonstructural protein1，NS1）、非結(jié)構(gòu)蛋白2（Nonstructural protein2，NS2）和

2、衣殼蛋白（Capsid protein，CP）進(jìn)行原核表達(dá)與多克隆抗體制備，結(jié)果顯示病毒的NS2和CP在 Escherichia coli中能夠成功表達(dá)，而NS1未能成功表達(dá)。對 NS2和 CP進(jìn)行蛋白純化時(shí)，純化結(jié)果顯示 NS2蛋白的純度較高，可用于多克隆抗體的制備，而CP蛋白的純度較低。NS2進(jìn)一步免疫新西蘭兔后，制備的抗血清效價(jià)較高，可用于后續(xù)病毒的檢測及其他相關(guān)研究。
　　本研究利用Matchmaker酵母雙雜交系統(tǒng)，將N

3、S1、NS2和CP序列分別構(gòu)建到酵母獵物載體pGADT7和誘餌載體 pGBKT7上，分別轉(zhuǎn)化至酵母AH109以檢測重組獵物載體和誘餌載體的自激活作用及對宿主的毒性作用，發(fā)現(xiàn)無自激活作用和毒性作用，隨后將重組獵物載體和誘餌載體兩兩共轉(zhuǎn)至酵母AH109中，涂布于SD/-Leu/-Trp固體培養(yǎng)基上，再點(diǎn)種至SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-gal固體培養(yǎng)基以鑒定編碼蛋白間的相互作用。表型鑒定結(jié)果顯示，只有共轉(zhuǎn)化有pGAD

4、T7-CP/pGBKT7-CP的酵母重組子能夠在 SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-gal上生長并顯藍(lán)，而其它重組子均不能在其上生長，表明病毒的CP能夠自身互作，而其他編碼蛋白間無相互作用。為了進(jìn)一步研究病毒CP自身互作的作用位點(diǎn)，分別從CP的N端和C端截短若干個(gè)氨基酸序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CP的自身互作是高度敏感的，序列中較少氨基酸片段的缺失將導(dǎo)致其自身互作的喪失。本研究為深入探討病毒的組裝機(jī)制和致病機(jī)理奠定了堅(jiān)實(shí)的理論基