β2腎上腺素受體激動劑萊克多巴胺、齊帕特羅對脂肪細胞瘦素合成及小鼠胚胎體外發(fā)育效應的研究.pdf

1、目的：
　　1.將前脂肪細胞株3T3-L1誘導為脂肪細胞后，通過添加不同劑量萊克多巴胺（ractopamine, RAC）或齊帕特羅（zilpaterol, ZIL）體外培養(yǎng)，探討RAC和ZIL影響3T3-L1脂肪細胞分泌蛋白--瘦素（Leptin）合成的機制，并驗證RAC和ZIL通過p38MAPK信號通路磷酸化調(diào)控3T3-L1脂肪細胞Leptin的合成機制，探討RAC和ZIL在女性脂肪細胞內(nèi)分泌紊亂及其相關疾病發(fā)生中的潛在作用。

2、
　　2.選取小鼠2-細胞胚胎，通過添加不同劑量RAC或ZIL體外培養(yǎng)，探討RAC和ZIL對小鼠胚胎發(fā)育率的影響，為RAC和ZIL對女性生殖健康的研究提供實驗依據(jù)。
　　材料和方法：
　　1.標本
　　1.1.3T3-L1前脂肪細胞株
　　3T3-L1前脂肪細胞株購買于中國科學院上海細胞庫。
　　1.2.實驗動物
　　購買4-6周齡SPF級昆明雌性小鼠，9-10周齡SPF級昆明雄性小鼠。在22-

3、25℃、光照/黑暗循環(huán)周期12 h、自由攝水進食的環(huán)境適應性喂養(yǎng)1周開始實驗。
　　2.實驗分組及方法
　　2.1.3T3-L1脂肪細胞分組及給藥處理
　　3T3-L1前脂肪細胞誘導成脂肪細胞。加入或不加p38MAPK信號通路抑制劑SB203580(10μmol/L)預處理30 min后分別給予不同劑量RAC、克倫特羅（clenbuterol, CLB）及 ZIL處理12 h、24 h后收集細胞，MTT法檢測細胞存活率

4、，Western blotting檢測p-p38MAPK、Leptin蛋白表達量的變化。本項實驗分組見表1、2。
　　表1.RAC處理3T3-L1脂肪細胞分組
　　此處為圖表省略
　　表2.ZIL處理3T3-L1脂肪細胞分組
　　此處為圖表省略
　　2.2.小鼠胚胎分組及給藥處理
　　獲取2-細胞胚胎，分別隨機分組：給予0、0.5、5、50μmol/L RAC及50μmol/L CLB處理，或0、0.

5、1、1、10μmol/L ZIL及10μmol/L CLB處理。每組約80個胚胎，觀察胚胎發(fā)育及胚胎形態(tài)變化情況。
　　3.統(tǒng)計學分析
　　3.T3-L1細胞數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（—x±s）表示，小鼠胚胎發(fā)育率數(shù)據(jù)以百分率表示。應用SPSS16.0統(tǒng)計學軟件進行分析，3T3-L1細胞數(shù)據(jù)采用t檢驗和單因素方差分析(One-Way ANOVA)，小鼠胚胎發(fā)育率數(shù)據(jù)采用卡方檢驗分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結

6、果：
　　1.RAC對3T3-L1脂肪細胞存活率、p-p38MAPK及Leptin蛋白表達的影響
　　加藥處理12 h后，各劑量RAC及CLB組細胞存活率顯著低于空白對照組(P?0.05)。在SB203580預處理后，50μmol/L RAC及CLB組細胞存活率顯著高于未添加SB203580組(P?0.01)。加藥處理12 h后，各劑量RAC及CLB組p-p38MAPK蛋白的表達量顯著高于空白對照組(P?0.05)。加入SB

7、203580，各組p-p38MAPK蛋白表達量顯著低于未添加SB203580各組(P?0.01)。加藥處理12 h后，各劑量RAC及CLB組leptin蛋白表達量顯著高于空白對照組(P?0.05)。加入SB203580，各組leptin蛋白表達量顯著低于未加SB203580各組(P?0.01)。加入RAC和CLB處理24 h各組蛋白表達量與12 h差異不具統(tǒng)計學意義(P﹥0.05)。
　　2.ZIL對3T3-L1脂肪細胞存活率、p

8、-p38MAPK及Leptin蛋白表達的影響
　　未加入SB203580時，各ZIL及CLB組12 h的細胞存活率顯著低于空白對照組(P<0.05)。在SB203580預處理后，各ZIL及CLB組細胞存活率顯著高于未添加SB203580各組(P<0.01)。加藥處理24 h，10μmol/L ZIL和CLB組細胞存活率顯著低于12 h組(P<0.05)。未加入SB203580時，加藥處理12 h、24 h后，1、10μmol/L

9、ZIL及CLB組p-p38MAPK蛋白表達量顯著高于空白對照組(P<0.05)。加入 SB203580各組 p-p38MAPK蛋白的表達量顯著低于未加入SB203580各組(P<0.01)。未加入SB203580時，細胞處理12 h后，各ZIL及CLB組Leptin蛋白表達量顯著高于空白對照組(P<0.05)，處理24 h后1、10μmol/L ZIL及CLB組Leptin蛋白表達量顯著高于空白對照組(P<0.05)。加入SB20358

10、0抑制劑，Leptin蛋白表達量顯著低于未加入SB203580各組(P<0.01)。
　　3.RAC對小鼠胚胎體外發(fā)育的影響
　　2-細胞胚胎時期，加入0.5μmol/L RAC后4-細胞發(fā)育率(70.3％)、8-細胞發(fā)育率(70.3%)明顯低于空白對照組(88.7%,87.3%)，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01, P<0.05)，但是囊胚發(fā)育率差異沒有統(tǒng)計學意義(P﹥0.05)。在5、50μmol/L RAC組囊胚發(fā)育率

11、(52.7%,47.1%)顯著低于空白對照組(74.7%, P<0.01)。加入RAC各組與空白對照組相比較胚胎顯示出粗顆粒，碎片及退化。
　　4.ZIL對小鼠胚胎體外發(fā)育的影響
　　隨著ZIL劑量的增加，胚胎的體外發(fā)育率逐漸下降，0.1、1、10μmol/L ZIL組和CLB組的囊胚率(57.5%、55.0%、51.3%和25.7%)與空白對照組(74.7%)相比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。加入ZIL使得部分胚胎

12、卵裂球碎裂，粗顆粒明顯增多。添加0.5μmol/L RAC與添加0.1μmol/L ZIL后對胚胎囊胚發(fā)育率差異不具統(tǒng)計學意義(P﹥0.05)，添加5μmol/L RAC與添加1μmol/L ZIL后對胚胎囊胚發(fā)育率差異不具統(tǒng)計學意義(P﹥0.05)，添加50μmol/L RAC與添加10μmol/L ZIL后對胚胎囊胚發(fā)育率差異不具統(tǒng)計學意義(P﹥0.05)。
　　結論：
　　1.3T3-L1脂肪細胞培養(yǎng)實驗結果表明，添加

13、RAC或ZIL后可使p-p38MAPK及Leptin蛋白表達水平升高，抑制p38MAPK信號通路后Leptin蛋白表達量下降，提示RAC和ZIL可影響脂肪細胞分泌蛋白--Leptin的合成，脂肪細胞內(nèi)分泌紊亂可能誘導IR的發(fā)生，導致女性生殖內(nèi)分泌功能紊亂性疾病如PCOS的發(fā)生。此外， RAC和ZIL可能通過激活p38MAPK信號通路影響Leptin蛋白的表達。本項研究RAC作用24 h后細胞存活率、p-p38MAPK及瘦素蛋白與12 h

14、變化差異不具統(tǒng)計學意義。ZIL作用24 h后與12 h相比較細胞存活率更低，p-p38MAPK、Leptin表達量增加，說明ZIL發(fā)揮生物學效應時間更長，若體內(nèi)殘留ZIL將比RAC對人體的影響時間更長。
　　2.小鼠胚胎實驗結果顯示，RAC和ZIL可以降低小鼠胚胎的體外發(fā)育率，胚胎碎片粗顆粒明顯增多，提示RAC和ZIL可通過增加胚胎自身碎片及粗顆粒阻礙胚胎發(fā)育，從而對女性生殖健康造成影響。低中高劑量濃度RAC和ZIL統(tǒng)計學比較結果