淡色庫蚊和鯽魚體內(nèi)乙酰膽堿酯酶的生物化學(xué)性質(zhì)比較研究.pdf

1、本文以淡色庫蚊(Culexpipienspallens)和鯽魚(Carassiusauratus)為研究對(duì)象，系統(tǒng)研究了淡色庫蚊和鯽魚體內(nèi)乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase，AChE)的生物化學(xué)特性及其對(duì)抑制劑的敏感度以及一些殺蟲藥劑對(duì)淡色庫蚊幼蟲的毒力。用親和柱層析技術(shù)對(duì)雌雄鯽魚魚腦AChE進(jìn)行了純化，比較分析了鯽魚性別之間的差別；并對(duì)雌雄鯽魚魚腦AChE基因進(jìn)行了克隆和序列分析。研究結(jié)果如下： 1.研究了

2、淡色庫蚊體內(nèi)和雌雄鯽魚腦部AChE的粗酶液對(duì)碘化硫代乙酰膽堿(ATCh)、β-甲基硫代乙酰膽堿(β-MTCh)、丙酰硫代膽堿(PrTCh)、丁酰硫代膽堿(BuTCh)4種底物專一性，根據(jù)Km值，淡色庫蚊的AChE對(duì)4種底物親和性的差異不顯著(P＜0.05)，而鯽魚腦部AChE對(duì)4種底物親和性的差異顯著(P＜0.05)，其中對(duì)ATCh的Km最小，Vmax最大。Vmax顯示，淡色庫蚊和鯽魚的AChE對(duì)4種底物水解效率的高低順序?yàn)锳TCh＞P

3、rTCh＞β-MTCh＞BuTCh。 2.毒扁豆堿、DDVP、涕滅威和滅多威對(duì)淡色庫蚊AChE以及3種氨基甲酸酯類農(nóng)藥對(duì)雄性和雌性魚腦AChE抑制的時(shí)間進(jìn)程曲線是一致的。通過比較8種殺蟲藥劑對(duì)淡色庫蚊和鯽魚AChE的IC50值，發(fā)現(xiàn)淡色庫蚊和鯽魚的AChE都對(duì)克百威的敏感度最高，對(duì)涕滅威最低。 3.基于LC50值的比較，在實(shí)驗(yàn)內(nèi)測定了9種藥劑對(duì)淡色庫蚊幼蟲的毒力，淡色庫蚊對(duì)毒死蜱的敏感度最高，LC50值為0.001μg/

4、mL，對(duì)硫雙滅多威的敏感性最低，LC50值為0.957μg/mL。滅多威、硫雙滅多威、克百威，丁硫克百威等4種藥劑對(duì)AChE的抑制能力(ki值和IC50)與其對(duì)淡色庫蚊毒力(LC50)值沒有一致的對(duì)應(yīng)關(guān)系。 4.以ATCh和BuTCh作為底物檢測雌雄鯽魚體內(nèi)不同組織器官中AChE和BuChE的活性，發(fā)現(xiàn)腦部所含的AChE的比活力最高，占所有組織的50％以上；鯽魚的肌肉中不但存在水解ATCh的AChE，也存在水解BuTCh的BuC

5、hE。 5.比較研究了不同性別鯽魚腦AChE對(duì)滅多威、硫雙滅多威、克百威，丁硫克百威等4種氨基甲酸酯類殺蟲劑的敏感度，硫雙滅多威對(duì)雌魚AChE的ki值顯著高于其對(duì)雄魚的ki值；4種藥劑對(duì)雌魚腦AChE的k2值都顯著大于對(duì)雄魚腦AChE的k2值。丁硫克百威抑制雌魚腦AChE的氨基甲酰化AChE的恢復(fù)速率明顯比雄魚腦AChE快(基于k3值的比較)。 6.研究了氯磷定(2-PAM)，雙磷定(TMB4)，雙復(fù)磷(OBI)和酰胺磷

6、定(HI-6)等4種AChE恢復(fù)劑對(duì)魚腦磷?；疉ChE的恢復(fù)能力?；谥鼗罨实谋容^，OBI對(duì)甲胺磷抑制AChE的恢復(fù)效果最好；OBI和TMB4對(duì)毒死蜱抑制AChE的恢復(fù)效果好，2-PAM對(duì)DDVP抑制AChE的恢復(fù)效果最好?；謴?fù)劑本身對(duì)AChE的活性都有一定的抑制作用，其中雙磷定(TMB4)對(duì)AChE的抑制率最高，在實(shí)驗(yàn)條件下達(dá)到44.9％，HI-6對(duì)AChE的抑制率最低為11.5％。 7.用親和層析的方法對(duì)雌雄魚腦AChE進(jìn)

7、行了較好的純化，對(duì)雌雄魚純化倍數(shù)分別為1521倍和2089.5倍。對(duì)純化前后的雌雄魚腦的AChE的生物化學(xué)特性及對(duì)藥劑的敏感性進(jìn)行了比較，雌雄鯽魚純化后AChE對(duì)ATCh親和力比純化前增加了(基于Km值的比較)，純化后的AChE對(duì)DDVP和丁硫克百威的敏感度明顯增加100倍左右。 8.通過RT-PCR分別克隆了鯽魚腦AChE基因片段，長度為1060bp，編碼353個(gè)氨基酸(Genbank上注冊(cè)號(hào)為AY847745)，并對(duì)其進(jìn)行了