美洲蟑螂乙酰膽堿酯酶的分離純化及性質(zhì)研究.pdf

1、本學(xué)位論文選用美洲蟑螂頭部作為實(shí)驗(yàn)酶源材料,首先采用正交實(shí)驗(yàn)對(duì)美洲蟑螂頭部AChE的酶活測(cè)定條件進(jìn)行了優(yōu)化,其次采用鹽酸普魯卡因胺親和層析法對(duì)蟑螂頭部AChE粗酶進(jìn)行了分離純化,最后測(cè)定了其純化酶對(duì)16種農(nóng)藥的敏感性,并與電鰻AChE、粗酶進(jìn)行了比較,為科學(xué)評(píng)估其是否可作為敏感酶源提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。主要研究成果如下:
　　1、美洲蟑螂AChE的酶活測(cè)定條件的優(yōu)化
　　美洲蟑螂AChE的基礎(chǔ)酶活較高,且其酶活測(cè)定最佳反應(yīng)體系條件為

2、:底物濃度1.0 mmol/L、酶凍干粉質(zhì)量濃度0.05 g/mL、溫度35℃、時(shí)間10 min、pH7.5,且這三種因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響程度從大到小是:pH值、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間。
　　2、美洲蟑螂頭部AChE的分離純化及特性研究
　　采用鹽酸普魯卡因胺親和層析法對(duì)美洲蟑螂頭部AChE粗酶進(jìn)行了分離純化,純化倍數(shù)為172.04倍,產(chǎn)率為16.18％;純化酶經(jīng)過(guò)SDS-PAGE電泳,其相對(duì)分子量約為78 kDa,與其它文獻(xiàn)報(bào)

3、道相近;蟑螂AChE的Km值為0.0402 mmol/L,電鰻AChE的Km值為0.0784 mmol/L,兩者對(duì)底物ATChI的親和力接近。
　　3、美洲蟑螂頭部AChE對(duì)常用農(nóng)藥的敏感性研究
　　(1)兩種 AChE對(duì)五種有機(jī)磷農(nóng)藥(包括:敵百蟲、敵敵畏、久效磷、速滅磷、氧化樂(lè)果)的IC50無(wú)明顯差異,其中對(duì)四種農(nóng)藥的敏感性基本保持在同一個(gè)數(shù)量級(jí),只有速滅磷有差異明顯,蟑螂 AChE對(duì)速滅磷敏感性要高于電鰻,IC50值分

4、別為9.1×10-8 mol/L和2.28×10-7 mol/L;對(duì)蟑螂AChE和電鰻AChE兩種純酶而言,敏感性最強(qiáng)的速滅磷與敏感性最弱的氧化樂(lè)果IC50之間分別相差700、180倍,范圍跨度較大。
　　(2)兩種AChE對(duì)七種氨基甲酸酯類農(nóng)藥(包括:速滅威、甲萘威、滅多威、涕滅威、克百威、丙硫克百威、丁硫克百威)的敏感性無(wú)顯著差異,IC50值均保持在10-6 M數(shù)量級(jí),但對(duì)異丙威的敏感性卻相差一個(gè)數(shù)量級(jí),蟑螂AChE、電鰻AC

5、hE對(duì)異丙威的IC50值分別為6.4×10-8、8.6×10-7 M;對(duì)蟑螂AChE和電鰻AChE兩種純酶而言,敏感性最強(qiáng)與敏感性最弱IC50之間分別相差41、33倍。
　　(3)兩種AChE對(duì)16種有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的敏感程度較為一致;對(duì)氨基甲酸酯類農(nóng)藥的敏感性要高于有機(jī)磷農(nóng)藥;對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥敏感性跨度范圍要大于氨基甲酸酯類農(nóng)藥。
　　(4)美洲蟑螂AChE純化后敏感性略有提高,對(duì)敵敵畏、敵百蟲、克百威的敏感性分別提高