新型乙酰膽堿酯酶生物傳感技術(shù)研究及有機(jī)磷檢測應(yīng)用.pdf

1、乙酰膽堿酯酶(Acetylcholinesterase，AChE)是一種主要存在于人類和動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的乙酰膽堿水解酶，其基本功能為催化水解神經(jīng)遞質(zhì)-乙酰膽堿(Acetylcholine，ACh)導(dǎo)致神經(jīng)沖動傳遞的終止，從而維持膽堿能神經(jīng)的正常生理功能。醫(yī)學(xué)上的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，例如老年癡呆癥和帕金森病等多與人體內(nèi)乙酰膽堿酯酶功能受到影響有關(guān)。
　　有機(jī)磷農(nóng)藥(Organophosphorus pesticides，OPs)與ACh

2、E結(jié)合會形成磷酰化ChE，磷?；疌hE很穩(wěn)定，使酶失去催化水解ACh的能力并逐漸老化，造成ACh在體內(nèi)的積累，最終導(dǎo)致膽堿能神經(jīng)先興奮后抑制。高含量的OPs可導(dǎo)致驚厥、呼吸困難、心律不齊、缺氧等急性中毒癥狀，低含量的OPs亦可經(jīng)長期慢性毒害導(dǎo)致心臟、肝臟、腎和其他器官的損害。
　　乙酰膽堿酯酶生物傳感技術(shù)具有靈敏度高、分析速度快、成本低、能在復(fù)雜體系中進(jìn)行在線連續(xù)監(jiān)測等優(yōu)點(diǎn)。近年來，乙酰膽堿酯酶生物傳感器已成為有關(guān)AChE及相關(guān)物

3、質(zhì)檢測研究最活躍的領(lǐng)域之一，建立新型的、有效的乙酰膽堿酯酶生物傳感分析技術(shù)對于健康、食品、環(huán)境監(jiān)測等仍然是一個熱門而有意義的研究課題。本論文圍繞開發(fā)易于操作、價格低廉和高靈敏信號轉(zhuǎn)換的AChE生物傳感方法開展了一些研究工作，主要內(nèi)容如下:
　　(1)基于尼羅紅吸附納米金的AChE熒光法檢測有機(jī)磷。納米金由于具有消光系數(shù)大、吸收光譜寬等優(yōu)良的光學(xué)性質(zhì)，常被用作為熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)的受體，是一種理想的熒光淬滅劑。第2章中將熒

4、光物質(zhì)尼羅紅非共價吸附在納米金的表面，利用納米金有效淬滅尼羅紅的熒光，形成一個低背景的熒光信號。當(dāng)存在AChE催化體系時，AChE催化底物硫代乙酰膽堿水解生成硫代膽堿，后者可與尼羅紅競爭結(jié)合納米金形成強(qiáng)的Au-S鍵，促使尼羅紅從納米金表面解吸附，并且產(chǎn)生一種比尼羅紅熒光更強(qiáng)的新熒光產(chǎn)物，體系熒光大大增強(qiáng)。當(dāng)存在有機(jī)磷時，AChE的活性被抑制，水解產(chǎn)物硫代膽堿減少，最終解吸附下的尼羅紅產(chǎn)物——新熒光物質(zhì)相應(yīng)地減少。利用納米金淬滅熒光的獨(dú)特

5、光學(xué)性質(zhì)，成功構(gòu)建了一種簡單、易操作、高靈敏的AChE熒光檢測方法。
　　(2)信號增強(qiáng)型的AChE熒光法高靈敏分析檢測有機(jī)磷。信號增強(qiáng)型分析法是從低的背景信號開始，加入少量的待測物便能形成可檢測信號，這使其具有更高的信噪比(signal-to-noise)從而具有更高的檢測靈敏度。在第3章中將方酸類染料能特異性識別巰基物質(zhì)的特性引入到AChE分析體系中，AChE催化底物硫代乙酰膽堿水解生成硫代膽堿，其進(jìn)一步特異性地親核取代方酸類

6、染料，淬滅方酸染料的熒光，生成很低的熒光背景。當(dāng)有機(jī)磷抑制AChE的催化水解反應(yīng)，水解產(chǎn)物硫代膽堿明顯地降低，方酸類染料得以保留。方酸類染料的保留值與有機(jī)磷的濃度成正比例增加?；诜剿犷惾玖夏芴禺愋宰R別AChE催化產(chǎn)物硫代膽堿的特性，結(jié)合熒光信號增強(qiáng)分析法的優(yōu)點(diǎn)，構(gòu)建了一種簡單、快速、高靈敏的熒光法分析檢測AChE抑制劑——對氧磷，檢測限為5pgmL-1。該方法是成功構(gòu)建的基于信號增強(qiáng)型的熒光法檢測AChE抑制劑。
　　(3)連續(xù)

7、信號放大的AChE電化學(xué)檢測有機(jī)磷。納米金顆粒能催化金屬離子還原形成復(fù)合物或者核殼結(jié)構(gòu)，提高分析檢測的靈敏度。在第4章中利用納米金催化金屬沉積實(shí)現(xiàn)信號放大策略，發(fā)展了AChE電化學(xué)法檢測有機(jī)磷。研究發(fā)現(xiàn)，在無納米金種子條件下，AChE的催化水解產(chǎn)物——硫代膽堿能還原AuCl4-生成納米金并沉積于電極上，納米金進(jìn)一步催化銅離子還原在金核表面生成大量的納米銅，最后采用溶出伏安法檢測生成的納米銅，增強(qiáng)電化學(xué)檢測的響應(yīng)信號。有機(jī)磷抑制AChE的

8、活性，水解產(chǎn)物硫代膽堿減少，進(jìn)而還原生成納米金量減少，最終納米金催化銅增強(qiáng)的量減少，電化學(xué)溶出伏安法檢測響應(yīng)信號減小，從而實(shí)現(xiàn)對有機(jī)磷的高靈敏檢測，其檢測限可低至0.02ngmL-1。
　　(4)基于納米金沉積信號放大的AChE液晶生物傳感器檢測乙酰膽堿和有機(jī)磷。基于納米顆粒增強(qiáng)擾亂液晶分子的有序排列，增強(qiáng)偏光顯微鏡的光學(xué)信號，實(shí)現(xiàn)高靈敏液晶生物傳感分析檢測。在第5章中將AChE催化調(diào)節(jié)納米金生成的現(xiàn)象引入到液晶生物傳感檢測技術(shù)中

9、，低濃度的AChE分子不會擾亂液晶分子的有序排列，而AChE催化調(diào)節(jié)生成納米金顆粒后，可極大地擾亂液晶分子的有序排列，顯著改變液晶的偏光效應(yīng)。底物乙酰膽堿和硫代乙酰膽堿與AChE競爭地結(jié)合，調(diào)控硫代膽堿產(chǎn)物的量，進(jìn)而調(diào)控還原生成納米金顆粒的量，實(shí)現(xiàn)AChE液晶生物傳感器對乙酰膽堿的檢測，檢測限可達(dá)15μM。有機(jī)磷——馬拉硫磷抑制AChE催化水解硫代乙酰膽堿，從而導(dǎo)致還原生成的納米金顆粒數(shù)量減少，對液晶有序性的擾亂程度減弱，偏光響應(yīng)效果也

10、相應(yīng)減弱，從而實(shí)現(xiàn)對有機(jī)磷的直觀而高靈敏的檢測，檢測限可達(dá)0.1ngmL-1。
　　(5)基于活化率差異的AChE液晶生物傳感器區(qū)別檢測有機(jī)磷。第6章的研究工作針對目前的AChE生物傳感技術(shù)對有機(jī)磷檢測無選擇性的缺點(diǎn)，基于同種復(fù)活劑對不同有機(jī)磷抑制的酶復(fù)活率不同并結(jié)合第5章的工作，嘗試發(fā)展一種區(qū)別檢測AChE抑制劑的新型AChE液晶生物傳感方法。在該檢測體系中，三種不同有機(jī)磷（甲胺磷、敵百蟲和對氧磷）抑制的AChE經(jīng)過同種復(fù)活劑活