葡萄球菌腸毒素A真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及其在喉癌Hep-2細(xì)胞來(lái)源exosomes中的錨定.pdf

1、目的：構(gòu)建葡萄球菌腸毒素A（staphylococcalenterotoxinA，SEA）與錨定蛋白GPI的真核表達(dá)質(zhì)粒pmiR-RB-REPORT-SEA-GPI，轉(zhuǎn)染喉癌Hep-2細(xì)胞，制備exosomes，檢測(cè)SEA在exosomes中的表達(dá)。
　　方法：利用NOTI雙酶切法切斷原核生物質(zhì)粒pGSI-SEA-GPI粘性末端（NOTI酶切位點(diǎn)），瓊脂糖電泳法分離目的基因-SEA-GPI-，普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑提取-SE

2、A-GPI-，利用T4連接酶連接真核表達(dá)質(zhì)粒pmiR-RB-REPORT與-SEA-GPI-，構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pmiR-RB-REPORT-SEA-GPI。脂質(zhì)體法將pmiR-RB-REPORT-SEA-GPI轉(zhuǎn)染喉癌Hep-2細(xì)胞，提取喉癌細(xì)胞中的RNA，熒光定量PCR（qRT-PCR）法檢測(cè)目的基因-SEA-GPI-在喉癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄情況。采用exosomes提取試劑盒提取喉癌細(xì)胞分泌的exosomes，透射電鏡對(duì)exosomes做形

3、態(tài)等鑒定，Westernblot測(cè)定SEA在exosomes中的表達(dá)。
　　結(jié)果：通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳法鑒定pmiR-RB-REPORT-SEA-GPI基因堿基序列，表明構(gòu)建成功。真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染喉癌細(xì)胞，qRT-PCR測(cè)出其在喉癌細(xì)胞中有效轉(zhuǎn)錄，透射電鏡成功觀測(cè)到轉(zhuǎn)染后喉癌細(xì)胞分泌的exosomes，Westernblot測(cè)出exosomes中有SEA表達(dá)，表明喉癌細(xì)胞分泌的exosomes含有SEA，SEA通過(guò)GPI結(jié)構(gòu)錨定于e