Miro1在難治性癲癇病人和動物模型中表達變化的研究.pdf

1、癲癇是一種經(jīng)系統(tǒng)功能障礙的疾病。通常情況下，癲癇是指大腦中的神經(jīng)元突然同步化異常放電，導致如凝視，痙攣等臨床表現(xiàn)與癥狀反復發(fā)作的慢性疾病。大約全球人口中5％的人在一生中至少經(jīng)歷過一次發(fā)作，并且全球約20%的人會在一生中經(jīng)歷反復發(fā)作。大部分的癲癇發(fā)作會被單一的抗癲癇藥物控制，而每個月發(fā)作一次上，用藥正確的情況下用藥超過三種，超過兩年治療仍然無效的是難治性癲癇[1]。大約有30%的癲癇病人屬于難治性癲癇（也稱為頑固性癲癇）[2]。近幾十年來

2、，諸多學者通過各種途徑實驗方法來探究癲癇發(fā)作的分子機制。人們盡管在癲癇發(fā)病的過程機制方面取得巨大的進展，但是仍然不能確定一種或者一類標志物作為診斷癲癇發(fā)病的標準。目前，各類癲癇的致病機制人們?nèi)匀皇遣磺宄模貏e是非原發(fā)性癲癇，而是比如頭部外傷造成的癲癇，腫瘤壓迫刺激導致的癲癇，炎癥或長時間熱性驚厥誘發(fā)的癲癇[3]。由于以上幾點，癲癇的病理機制是多種因素與途徑導致的，所以沒有一個單一的癲癇發(fā)病黃金病理機制。在過去的幾十年中間，人們治療癲癇

3、是阻止癲癇發(fā)生的急性過程[4]，而現(xiàn)在醫(yī)生們在治療癲癇的觀念上一方面是阻止降低原發(fā)性自發(fā)發(fā)作，另一方面是治療患者的癲癇相關并發(fā)癥，比如認知損傷和心理健康的損害[5,6]。全世界的研究者到目前為止在各種動物癲癇模型中發(fā)現(xiàn)并驗證的癲癇發(fā)病的分子水平和細胞水平的改變有：細胞死亡和神經(jīng)元損傷，軸突與樹突的可塑性，
　　神經(jīng)的發(fā)生，膠質細胞的活化，血管損傷和生成，細胞外基質的破裂，離子通道的結構和功能的改變，突出前與突出后的修飾[7]。隨著

4、研究的進展，近年來研究發(fā)現(xiàn)癲癇發(fā)生和能量代謝失衡關系十分密切，能量代謝物質的不平衡會導致或誘發(fā)癲癇的發(fā)生。
　　與此同時，更多的新研究發(fā)現(xiàn)癲癇與腦內(nèi)能量供給的重要細胞器線粒體關系十分密切。相關文獻報道大腦線粒體代謝功能異常對癲癇發(fā)病起著重要的作用[8]。近年來，線粒體運動這一概念出現(xiàn)在人們的視野中，線粒體可以通過蛋白鏈接至微管[9]。在神經(jīng)元中，由馬達蛋白帶領的線粒體可從胞體運輸至需要大量能量供應的突觸附近。在線粒體的運輸中，Mi

5、ro1是一個至關重要的蛋白，它一端鏈接線粒體外膜，另一端鏈接蛋白復合體與微管相連[10]。基于此，為了探尋Miro1以及線粒體運輸是否與癲癇具有緊密聯(lián)系，我們做以下研究：
　　第一部分 Miro1在癲癇患者樣本中的表達分析
　　目的：研究Miro1在臨床樣本的表達情況。方法：從某大學附屬醫(yī)院神經(jīng)外科標本庫隨機選取20例顳葉癲癇組織標本作為實驗組，10例外傷組織作為對照組。利用Western blot檢測Miro1在臨床癲癇樣

6、本顳葉皮質以及海馬中的蛋白表達情況，同時用q-PCR檢測其mRNA表達情況，以及使用免疫組織化學染色鑒定顳葉皮質中Miro1的表達以驗證Western blot結果。結果：Miro1蛋白表達在癲癇組顳葉皮質及海馬中與對照組相比顯著降低，免疫組織化學染色結果也印證了此降低趨勢，mRNA表達無明顯差異。結論：臨床樣本中Miro1在顳葉皮質以及海馬中表達均顯著降低，這提示顳葉癲癇患者病灶區(qū)低代謝可能與Miro1的減少有關，Miro1在癲癇發(fā)生

7、過程中發(fā)揮重要作用。mRNA表達無差異而蛋白表達減少，提示可能癲癇發(fā)作時Miro1蛋白通過線粒體自噬代謝降解增多。
　　第二部分 Miro1在癲癇動物模型中的表達分析
　　目的：由于人類癲癇樣本在研究癲癇發(fā)病過程方面的限制性，我們研究Miro1在癲癇動物模型中全過程的表達情況。方法：建立SD大鼠氯化鋰-匹羅卡品模型并以注射生理鹽水組為對照，在模型建立成功后在不同時間點(SE1d、SE3d、SE5d、SE7d、SE14d、SE

8、30d、SE60d組)收集大鼠顳葉及海馬組織,每組8只。利用Western blot，q-PCR以及免疫組織化學檢測Miro1在癲癇大鼠皮層及海馬組織中的表達。結果：Miro1蛋白表達在癲癇動物模型顳葉皮質急性期升高（SE1d，SE3d），恢復期前期升高（SE5d，SE7d），恢復期后期降低（SE14d），慢性期顯著降低（SE30d，SE60d)。Miro1在海馬中蛋白表達急性期升高（SE1d、SE3d），恢復期和慢性期降低（SE5d、

9、SE7d、SE14d、SE30d、SE60d）。同時我們對表達增高明顯的SE3d和降低顯著的SE60d進行免疫組織化學染色的結果表明與蛋白表達趨勢一致，并且有明顯的軸突染色。Miro1的mRNA趨勢與蛋白表達趨勢相反。結論：癲癇動物模型在慢性期與癲癇臨床樣本一致，Miro1蛋白表達顯著降低，而在急性期，Miro1表達顯著升高，這一動態(tài)變化提示我們Miro1可能與癲癇的發(fā)病過程是息息相關的。mRNA與蛋白表達水平趨勢相反，有可能是由于急性

10、期Miro1增高通過負反饋作用mRNA表達降低；而慢性期自發(fā)發(fā)作期，與人類癲癇病程相似，自發(fā)發(fā)作期線粒體自噬增強，Miro1降解加快。
　　第三部分 Miro1和線粒體的分布在動物模型中的研究
　　目的：探究Miro1的表達的變化是否對線粒體分布產(chǎn)生影響。方法：將大鼠分為對照組，SE3d組，SE60d組，每組8只。建立SD大鼠氯化鋰-匹羅卡品模型，在每只大鼠取腦前7天，通過立體定向注射將線粒體活性染料Mitotracker注

11、入左側側腦室內(nèi)。之后取腦，做冰凍切片，免疫熒光染色，共聚焦顯微鏡觀察。結果：綠色熒光的Miro1蛋白表達與第二部分免疫組織化學染色一致，急性期增高，慢性期降低。同時綠色熒光的位置與紅色熒光的線粒體共表達，證實我們之前結果的準確性。紅色熒光的線粒體，對照組分布正常，急性期Miro1表達升高時線粒體向核周聚集，慢性期Miro1表達降低時線粒體瓦解散落。結論：該部分實驗確實了之前部分的結果，并且發(fā)現(xiàn)隨著Miro1蛋白表達變化線粒體分布也發(fā)生變