脊髓Rac1-PAK信號(hào)通路在蜜蜂毒誘導(dǎo)炎性痛發(fā)生和維持中的作用機(jī)制.pdf

1、疼痛（Pain）是具有生物學(xué)意義的警戒信號(hào)，對機(jī)體具有自身保護(hù)作用。然而，急性痛長期遷延不愈時(shí)就會(huì)誘發(fā)慢性痛，不僅能造成感覺神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙，同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致焦慮、抑郁和認(rèn)知障礙等精神共病，嚴(yán)重影響人們的工作、學(xué)習(xí)和生活。既往50年的研究在傷害性信號(hào)從外周到脊髓的神經(jīng)傳導(dǎo)，以及外周敏化和脊髓中樞敏化機(jī)制等方面上取得較大進(jìn)展。但是，由急性痛向慢性痛的演變過程，及其神經(jīng)調(diào)控機(jī)制至今仍舊不清。這為臨床有效診治慢性痛設(shè)置了障礙。目前，探索疼痛發(fā)生、

2、發(fā)展和慢性化機(jī)制的研究既是國際前沿神經(jīng)科學(xué)研究的熱點(diǎn)，也是醫(yī)學(xué)難題之一。
　　外周組織損傷和持續(xù)性炎癥對機(jī)體是一種非常強(qiáng)烈而長期的有害刺激。組織損傷后，組織內(nèi)的ATP、H+、K+等炎癥介質(zhì)釋放，從而引起P2X3、TRPV1、TRPV2等通道激活，促使脊髓傷害感受性神經(jīng)元保持高興奮狀態(tài)，并伴隨交感神經(jīng)活化。同時(shí)，外周組織損傷和炎癥導(dǎo)致傷害性感受器閾值降低，引起外周敏化。當(dāng)持續(xù)性的傷害性刺激信號(hào)傳導(dǎo)至脊髓背角后，能夠引起傷害性感受神經(jīng)

3、元的激活和敏化即出現(xiàn)所謂的神經(jīng)可塑性變化，如后放電、wind up現(xiàn)象、LTP等中樞敏化現(xiàn)象。脊髓膠質(zhì)細(xì)胞的活化、抑制性神經(jīng)元活性降低以及源自脊髓上位腦結(jié)構(gòu)，包括丘腦、皮層、扣帶回、島葉、腦干等的下行痛抑制系統(tǒng)作用的削弱和下行易化系統(tǒng)作用的增強(qiáng)都參與和誘導(dǎo)傷害性反應(yīng)在脊髓背角的表達(dá)和敏化，最終導(dǎo)致脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元興奮性增強(qiáng)，進(jìn)而易化傷害性反射，形成持續(xù)性自發(fā)痛、痛敏、異常痛敏以及鏡像痛（或痛敏）。
　　經(jīng)過10余年的持續(xù)性研究，

4、我們實(shí)驗(yàn)室證實(shí)蜜蜂毒（bee venom,BV）痛模型能夠很好地模擬臨床炎性痛的病理性狀態(tài)特征。向大鼠足底注射蜜蜂毒溶液，不僅可以即刻引起大鼠局部注射區(qū)組織出現(xiàn)長時(shí)程的紅腫、滲出等炎性痛表現(xiàn)，而且還可以誘發(fā)出單相、時(shí)程持續(xù)達(dá)72～96小時(shí)的自發(fā)性縮足反應(yīng)行為以及抬足、舔足等特別關(guān)愛受傷足部的行為活動(dòng)。此外，BV注射后2小時(shí)，注射部位可出現(xiàn)原發(fā)性熱痛敏和原發(fā)性機(jī)械痛敏，而注射部位遠(yuǎn)端出現(xiàn)繼發(fā)性熱痛敏，注射對側(cè)足出現(xiàn)鏡像熱痛敏等。蜜蜂毒模型

5、與以往的福爾馬林、角叉菜膠、酵母多糖等疼痛模型不同，它不僅無種屬差異性，還具有較多的疼痛表型。因此，蜜蜂毒模型是研究病理性痛涉及外周和中樞敏化機(jī)制的一個(gè)理想的疼痛模型。本課題工作主要基于兩方面目的，一方面探索何種脊髓或者外周信號(hào)分子參與蜜蜂毒引起的傷害性反應(yīng)和相應(yīng)痛覺敏化現(xiàn)象的發(fā)生和維持過程；另一方面，以臨床治療為目的，通過蜜蜂毒模型，為臨床病理性痛的防治提供新的藥物治療靶點(diǎn)，從而有效緩解患者的持續(xù)性或慢性痛。
　　Rac1，又稱

6、Ras的C3肉毒素底物1（Ras-related C3 botulinum toxin substrate1,Rac1）蛋白是一種Rho家族成員小G蛋白。大量研究表明，Rac1參與對細(xì)胞增殖、分化、凋亡的調(diào)節(jié)，還與神經(jīng)元的發(fā)育、存活和神經(jīng)退行性病變密切相關(guān)。有研究指出，Rac1不僅與神經(jīng)元突觸的可塑性變化相關(guān)，而且參與調(diào)節(jié)神經(jīng)病理性痛狀態(tài)下的脊髓神經(jīng)元樹突棘的形態(tài)以及突觸的興奮性和信號(hào)傳遞過程。Tan等在多種神經(jīng)病理性痛模型中發(fā)現(xiàn)，外周

7、神經(jīng)損傷后10天、脊髓損傷和燙傷后28天，脊髓樹突棘的數(shù)量、棘頭的大小和長度都發(fā)生改變，且背角WDR（wide dynamic range）神經(jīng)元超興奮，出現(xiàn)熱痛敏和機(jī)械痛敏現(xiàn)象；鞘內(nèi)連續(xù)3天給予Rac1特異性抑制劑NSC23766可翻轉(zhuǎn)樹突棘的異常改變，并降低脊髓背角WDR神經(jīng)元的興奮性，從而有效緩解神經(jīng)病理性痛相關(guān)行為。然而迄今為止，在炎性痛條件下涉及脊髓Rac1信號(hào)通路的作用并未見報(bào)道。基于此，本課題通過蜜蜂毒模型研究Rac1-P

8、AK信號(hào)通路是否參與外周炎性痛的發(fā)生和發(fā)展。采用蜜蜂毒模型和鞘內(nèi)給予Rac1抑制劑的方式，利用免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)觀察Rac1在大鼠脊髓背角中的表達(dá)和細(xì)胞定位分布；應(yīng)用western blotting法觀察Rac1及其下游信號(hào)分子蛋白的表達(dá)變化；利用行為藥理學(xué)的方法評估Rac1抑制劑對蜜蜂毒所致自發(fā)痛、熱痛敏和機(jī)械痛敏的抑制作用。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：
　　1.Rac1在大鼠脊髓背角中的表達(dá)和細(xì)胞定位分布
　　免疫熒光組

9、織化學(xué)技術(shù)顯示Rac1在正常大鼠脊髓背角的淺層（I-II）和深層（III-VI）均有廣泛分布，且Rac1與NeuN存在共標(biāo)現(xiàn)象，而與GFAP和Iba1則極少共標(biāo)。以上結(jié)果提示相對于星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞，Rac1主要集中表達(dá)于神經(jīng)元胞體中。在大鼠一側(cè)足底接受生理鹽水或BV注射后，免疫熒光雙標(biāo)記法發(fā)現(xiàn)Rac1仍然主要分布于神經(jīng)元的胞漿中。盡管BV可以引起單位面積下大鼠脊髓淺層（I-II）和深層（III-VI）的GFAP和Iba1的數(shù)量增

10、多，但是與Rac1共標(biāo)的陽性數(shù)并沒有明顯增多，仍與GFAP和Iba1有極少的共標(biāo)。
　　2.脊髓Rac1信號(hào)通路在大鼠BV引起的炎性痛狀態(tài)下的變化
　　通過Western blotting法檢測大鼠脊髓組織中目的蛋白，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Rac1及其下游信號(hào)分子PAK磷酸化水平在大鼠足底注射蜜蜂毒2h后明顯增高，而經(jīng)過致炎處理后脊髓組織中的Rac1和PAK總蛋白的相對表達(dá)量無明顯變化。提示，在外周持續(xù)性痛狀態(tài)下Rac1信號(hào)通路被激活。脊

11、髓鞘內(nèi)給予NSC23766后, Rac1及其下游信號(hào)分子PAK的磷酸化水平被有效翻轉(zhuǎn)。此外，通過Rac1激活試劑盒檢測Rac1活性，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)一側(cè)足底注射蜜蜂毒可引起脊髓雙側(cè)Rac1的活性水平顯著增加，且Rac1的高活性表達(dá)可被鞘內(nèi)注射NSC23766完全翻轉(zhuǎn)。既往研究證明絲裂原激活蛋白激酶是GTP-Rac1-PAK的下游分子靶點(diǎn)，且課題組前期實(shí)驗(yàn)已證實(shí)炎性痛刺激可引起MAPK的激活，表現(xiàn)為ERK1/2和p38 MAPK磷酸化水平增加。

12、因此，本實(shí)驗(yàn)中我們深入觀察炎性痛狀態(tài)下Rac1信號(hào)通路是否參與MAPK信號(hào)通路的調(diào)控。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Rac1抑制劑NSC23766可顯著降低BV引起的p-ERK和p-p38增加，而ERK和p38總蛋白沒有明顯變化。
　　3.鞘內(nèi)給藥阻斷Rac1信號(hào)通路對BV引起的炎性痛的作用
　　在行為藥理學(xué)水平上，BV注射前給予NSC23766能夠劑量依賴性地完全抑制蜜蜂毒誘致的持續(xù)性自發(fā)痛反應(yīng)和原發(fā)性熱痛敏、鏡像熱痛敏，以及部分抑制原發(fā)性

13、機(jī)械痛敏，但不抑制對側(cè)機(jī)械痛敏；BV注射后2h給予NSC23766（后處理）能夠完全抑制蜜蜂毒皮下注射所誘致的原發(fā)性熱痛敏、鏡像熱痛敏，部分抑制原發(fā)性機(jī)械痛敏。
　　4.鞘內(nèi)注射NSC23766對大鼠運(yùn)動(dòng)功能的影響
　　利用Rota-Rod裝置我們檢測了NSC23766對正常大鼠運(yùn)動(dòng)能力的影響。我們發(fā)現(xiàn)，在前三次實(shí)驗(yàn)中，正常大鼠在儀器上的運(yùn)動(dòng)時(shí)間呈線性增多，而后五次大鼠在儀器上運(yùn)動(dòng)的時(shí)間趨于穩(wěn)定。與對照組相比，Rac1對正常

14、SD大鼠的運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力沒有影響。
　　結(jié)論:
　　1、細(xì)胞水平上，Rac1廣泛分布在脊髓背角淺層（I-II）和深層（III-VI），并與NeuN存在共標(biāo)，表明Rac1主要表達(dá)于神經(jīng)元胞體中。然而Rac1與GFAP和Iba1有極少的共標(biāo)。說明Rac1主要通過神經(jīng)元發(fā)揮作用。
　　2、外周炎性痛條件下，脊髓背角GTP-Rac1-PAK-ERK/p38 MAPK信號(hào)通路被激活，而特異性抑制劑可阻斷Rac1的活性及其下游MAP