IL-12通過下調(diào)Stat-3誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分化為M1型并且抑制肝癌細(xì)胞生長.pdf

1、目的：研究重組腺病毒pAd5F35-IL-12成功感染人外周血單核細(xì)胞后，高表達(dá)IL-12的單核細(xì)胞是否可以誘導(dǎo)其成為抑制肝癌細(xì)胞生長的M1型巨噬細(xì)胞，探討是否與Stat-3信號(hào)通路有關(guān)。
　　方法：采用Ficoll-Paque分離液分離新鮮的人外周血單核細(xì)胞，然后讓重組腺病毒pAd5F35-IL-12感染單核細(xì)胞。感染腺病毒48小時(shí)后的單核細(xì)胞和人肝癌細(xì)胞株（SMMC-7721和Hep3B）在共培養(yǎng)小室中進(jìn)行體外共培養(yǎng)，每一種肝

2、癌細(xì)胞株都分別設(shè)立3個(gè)實(shí)驗(yàn)組，分別是空白組（ SMMC-7721和 Hep3B），空載組（ SMMC-7721/GFP和Hep3B/GFP），目的組（SMMC-7721/IL-12和Hep3B/IL-12）。分別檢測兩種肝癌細(xì)胞共培養(yǎng)體系中IL-12的表達(dá)情況，單核細(xì)胞分化表型及Stat-3信號(hào)通路的變化以及體內(nèi)外肝癌細(xì)胞的生長情況。采用熒光顯微鏡觀察感染了帶有綠色熒光蛋白的重組腺病毒pAd5F35-IL-12的單核細(xì)胞是否發(fā)出綠色熒光

3、，使用RT-PCR方法檢測IL-12的P35、P40亞基的mRNA水平的表達(dá)情況，ELISA方法檢測共培養(yǎng)體系培養(yǎng)基中IL-12 P70蛋白的表達(dá)水平。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測共培養(yǎng)體系中的單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞的表面分化標(biāo)志CD197(M1型巨噬細(xì)胞表面分化標(biāo)志)和CD206(M2型巨噬細(xì)胞表面分化標(biāo)志)的平均熒光強(qiáng)度值MFI，分別使用定量PCR方法和ELISA方法檢測共培養(yǎng)上清中巨噬細(xì)胞表型分化相關(guān)因子IL-10、IL-12、TGF-β、

4、VEGF-A、MMP-9的表達(dá)情況。進(jìn)一步采用Western blot方法檢測共培養(yǎng)體系中過表達(dá)IL-12的單核細(xì)胞的Stat-3信號(hào)分子及其下游c-myc基因的變化情況。最后在體內(nèi)外分別研究肝癌細(xì)胞的生長情況，在體外實(shí)驗(yàn)中，CCK8法和細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)檢測肝癌細(xì)胞的增殖情況，流式細(xì)胞術(shù)檢測共培養(yǎng)后肝癌細(xì)胞的細(xì)胞周期變化，transwell實(shí)驗(yàn)檢測肝癌細(xì)胞的侵襲能力；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，觀察NOD/SCID小鼠中成瘤情況和繪制腫瘤生長曲線，免疫組織

5、化學(xué)方法檢測腫瘤生長相關(guān)指標(biāo)（PCNA、MVD）表達(dá)情況。
　　結(jié)果：重組腺病毒pAd5F35-IL-12能夠感染新鮮分離的人外周血單核細(xì)胞，發(fā)出綠色熒光，分泌表達(dá)IL-12 P70蛋白；在單核細(xì)胞和肝癌細(xì)胞的共培養(yǎng)體系中，和空白組和空載組相比，目的組中過表達(dá)IL-12的單核細(xì)胞CD197、IL-12的表達(dá)升高，CD206、IL-10、TGF-β、VEGF-A、MMP-9的表達(dá)下降，Stat-3和c-myc基因的mRNA和蛋白水平

6、都下降；體外實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)體系中，和空白組和空載組相比，目的組中肝癌細(xì)胞的瑞氏染色形態(tài)變化明顯，細(xì)胞變圓，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)之間的邊界變模糊；CCK-8實(shí)驗(yàn)和克隆形成實(shí)驗(yàn)中目的組的肝癌細(xì)胞株的細(xì)胞增殖能力下降，克隆形成率下降；目的組肝癌細(xì)胞周期G1期升高，S期下降；目的組肝癌細(xì)胞侵襲能力下降。動(dòng)物移植瘤模型實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，目的組肝癌成瘤時(shí)間延長，腫瘤生長率下降，增殖細(xì)胞核抗原PCNA陽性細(xì)胞率下降，平均血管密度MVD減少。