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文檔簡介
1、STAT2是核轉錄因子STAT家族成員,JAK/STAT途徑是其活化的經(jīng)典途徑,STAT2通過酪氨酸磷酸化而具有轉錄活性。RSK2是絲氨酸/蘇氨酸激酶家族成員,可磷酸化多種底物,從而在不同刺激下在特定微環(huán)境中調節(jié)細胞增殖、分化、凋亡、存活等生物學效應。
目的:探討RSK2活化STAT2促進單核細胞分化的機制。
方法:用CheckMateTM Mammalian Two-Hybrid system結合報道基因技術研究R
2、SK2與STAT2的相互作用,根據(jù)RSK2功能域,構建RSK2不同缺失片段的真核表達質粒,分別與pCMV-Myc-STAT2質粒共轉染HEK293細胞,免疫共沉淀技術探討RSK2與STAT2結合及結合的具體功能域;構建Cy1(VH3)-luc報告質粒,與pcDNA4-RSK2和pCMV-Myc-STAT2共轉染HEK293,檢測熒光素酶活性;熒光顯微鏡術和胞漿胞核分離結合免疫印跡技術檢測PMA刺激下STAT2的核移位;PMA刺激HEK2
3、93細胞,不同時間點收集細胞裂解液,免疫沉淀技術結合免疫印跡技術檢測STAT2的絲氨酸-蘇氨酸磷酸化;純化獲得GST-STAT2融合蛋白作為底物,免疫共沉淀獲得活化RSK2作為激酶,進行體外激酶實驗,檢測STAT2的磷酸化;轉染RSK2和STAT2質粒于單核細胞THP-1,PMA刺激后,直接光學顯微鏡觀察和流式細胞術觀察細胞形態(tài)變化、采用XTT實驗間接檢測細胞貼壁率。
結果:RSK2通過N-端與STAT2結合,PMA刺激下RS
4、K2磷酸化STAT2,促進STAT2的反式轉錄活性和核移位。體外實驗證明STAT2的C-端和N-端存在被RSK2磷酸化的絲氨酸殘基。初步實驗表明活化的RSK2激活STAT2促進THP-1分化。
結論:PMA刺激活化MAPK/ERK1/2/RSK2途徑,活化的RSK2使STAT2發(fā)生絲氨酸/蘇氨酸磷酸化并移位入核,發(fā)揮反式轉錄活性,進而促進THP-1單核細胞分化為巨噬細胞。我們的研究為通過對信號轉導途徑的研究闡明細胞生物學行為分
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