苦瓜蛋白MAP30的克隆、表達(dá)及其抗病毒作用研究.pdf

1、目的：通過分子生物學(xué)的方法從苦瓜中克隆和表達(dá)了MAP30，并對其在哺乳細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運途徑和抗病毒機(jī)制進(jìn)行了初步的研究，旨在揭示其抗病毒和抗腫瘤作用的機(jī)制。
　　 方法：從成熟苦瓜種子中提取其基因組DNA，通過PcR的方法擴(kuò)增出MAP30基因的全長，并將其連入原核表達(dá)載體pET30a，轉(zhuǎn)入E.coli BL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)3-5 h，離心收集菌液，超聲破碎分析上清和沉淀，并選用Ni-NTA進(jìn)行親和純化。于浙江大學(xué)動物

2、房購買健康的新西蘭雄兔2只，用免疫學(xué)方法制備MAP30的多克隆抗體，初次免疫用1 mg MAP30和等量的弗氏完全佐劑，再次免疫用0.5 mgMAP30和等量的弗氏不完全佐劑每隔兩周免疫一次，一共四次。免疫前，兔子耳緣靜脈采血，分離血清為對照，免疫后血清ELISA法測抗體的效價，Western blot測抗體的特異性。采用MTT方法檢測MAP30對腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞的殺傷作用，并用此方法比較MAP30對轉(zhuǎn)入HBV的H印G2細(xì)胞和其原型H

3、印G2細(xì)胞的細(xì)胞毒性。分析MAP30、天花粉蛋白(Trichosanthin，TCS)、拉米夫定對HepG2.2.15的細(xì)胞毒性，選取其對細(xì)胞毒性最小的濃度范圍進(jìn)行HBV抑制的體外實驗。ELIsA方法檢測MAP30、TCS、拉米夫定對HepG2.2.15細(xì)胞上清液中HBsAg、HBeAg的抑制作用，Real-time PCR方法檢測其對HBV DNA的抑制作用。并在不同離子作用下，檢測MAP30對DNA的切割作用。免疫電鏡的方法觀察MA

4、P30在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運途徑。
　　 結(jié)果：通過PCR方法克隆出MAP30的基因，測序結(jié)果與文獻(xiàn)報導(dǎo)的相符。通過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，得到了一條分子量約為34 kD的目的條帶，以可溶性和包涵體兩種形式表達(dá)，可溶性含量較多。上清經(jīng)過鎳柱親和純化，用不同濃度梯度的咪唑進(jìn)行洗脫，在100mM咪唑中洗脫下較純的MAP30，透析除去咪唑，Bradford法測濃度后，過濾除菌，-20℃保存。ELISA法測抗體的效價為128000，Wester

5、n blot測抗體的特異性發(fā)現(xiàn)除了34kD的目的條帶外，還有一條分子量約為MAP30兩倍的條帶，經(jīng)檢測，其為MAP30的二聚體。MAP30對腫瘤細(xì)胞Hela、HepG2的毒性遠(yuǎn)大于對正常細(xì)胞LO2的細(xì)胞毒性，SPSS軟件計算MAP30對癌細(xì)胞HepG2和Hela細(xì)胞的IC50分別為8.28μg/ml和6.92μg/ml；對LO2細(xì)胞，MAP30的IC50大于400μg/ml。MAP30對轉(zhuǎn)入HBV的HepG2.2.15細(xì)胞毒性要小于原型

6、HepG2細(xì)胞。在濃度為0.1-100μg/ml下，MAP30、TCS、拉米夫定對HepG2.2.15的細(xì)胞毒性均低于15％。在此濃度下，MAP30、TCS、拉米夫定對HepG2.2.15上清液中HBsAg、HBeAg和HBV DNA均有抑制，其抑制作用具有劑量依賴性。MAP30能將超螺旋DNA切割成缺口環(huán)狀或線性DNA，并具有劑量依賴性。在不同離子作用下，MAP30對DNA的切割作用不同。免疫電鏡的方法直接觀察到了MAP30在細(xì)胞內(nèi)主

7、要集中于細(xì)胞核。MAP30作用細(xì)胞后，電鏡觀察到細(xì)胞自噬體形成。
　　 結(jié)論：MAP30對腫瘤細(xì)胞的毒性大于對正常細(xì)胞的細(xì)胞毒性。MAP30對轉(zhuǎn)染HBV的HepG2.2.15細(xì)胞的毒性要小于原型HepG2細(xì)胞的細(xì)胞毒性。在低毒性劑量下，MAP30具有抑制HBV的作用，其抑制作用具有劑量依賴性。MAP30進(jìn)入細(xì)胞后，可以運輸進(jìn)入細(xì)胞核，從而干擾病毒的復(fù)制，其可能的作用機(jī)制為MAP30對細(xì)胞核內(nèi)的DNA的切割作用。MAP30作用細(xì)胞