AIV神經(jīng)氨酸酶基因的克隆表達(dá)及抗病毒活性研究.pdf

1、神經(jīng)氨酸酶(NA)是禽流感病毒的兩種表面糖蛋白之一，屬Ⅱ型糖蛋白，是一種糖苷外切酶，具有酶切活性。NA具有雙重功能，一方面對于流感病毒本身而言，它可以裂解唾液酸和附近的糖殘基之間的α-糖苷鍵，有利于子代病毒釋放出來，并且在子代病毒從宿主細(xì)胞表面釋放時能防止病毒聚集，促進(jìn)病毒穿過覆蓋在呼吸道上皮細(xì)胞的黏液而擴(kuò)散；另一方面對于宿主細(xì)胞而言，由于宿主細(xì)胞膜上的神經(jīng)氨酸(又名唾液酸，SA.)是流感病毒的主要受體，流感病毒與宿主細(xì)胞膜上SA受體結(jié)

2、合后，才能進(jìn)入細(xì)胞。而NA可以降解宿主細(xì)胞膜上的SA受體，抑制病毒進(jìn)入細(xì)胞，使細(xì)胞免受AIV的感染。由于NA這一獨(dú)特功能特點(diǎn)對防治AIV具有重要的意義，使其成為國內(nèi)外抗禽流感病毒研究的熱點(diǎn)之一，同時也為制備抗禽流感轉(zhuǎn)基因家禽提供了新思路。本研究通過克隆NA基因，進(jìn)行體內(nèi)外表達(dá)、亞細(xì)胞定位及抗病毒活性檢測，旨在探索將NA基因用于研制抗病轉(zhuǎn)基因家禽的新思路。主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下：
　　 1.NA基因的克隆、序列分析及原核表達(dá)。設(shè)計

3、合成NA基因特異性引物，以質(zhì)粒pGEM-T-NA為模板，采用大引物PCR定點(diǎn)誘變技術(shù)將NA基因突變修正后克隆至pMD19-T Vector中，酶切與測序結(jié)果均表明pMD19-T-NA構(gòu)建正確，且NA基因ORF正確無誤。然后將NA基因定向克隆入載體pGEX-6P-1中，構(gòu)建原核表達(dá)載體pGEX-NA；經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE電脈分離，免疫印跡檢測表明，重組NA蛋白獲得了表達(dá)，且抗NA血清可識別表達(dá)產(chǎn)物。
　　 2.神經(jīng)

4、氨酸酶基因表達(dá)質(zhì)粒免疫小鼠的研究。將NA基因定向克隆入pcDNA3.0載體中，構(gòu)建表達(dá)載體pcDNA3.0-NA，采用不同免疫方式，分別以不同劑量的表達(dá)質(zhì)粒免疫BALB/c小鼠；免疫后不同時間采集血液，分離收集血清；ELISA檢測分析免疫效應(yīng)。結(jié)果表明，所構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.0-NA免疫小鼠后可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體。
　　 3.體外重組神經(jīng)氨酸酶的表達(dá)及其亞細(xì)胞定位研究。構(gòu)建攜帶有EGFP報告基因融合表達(dá)載體pcDNA

5、3.0/EGFP-NA，并與pcDNA3.0-NA分別用PEI介導(dǎo)轉(zhuǎn)染NIH-3T3細(xì)胞系。轉(zhuǎn)染48 h后，前者直接在熒光倒置顯微鏡下觀察綠色熒光在細(xì)胞中的位置，后者先經(jīng)間接免疫熒光檢測，然后再在顯微鏡下觀察熒光在細(xì)胞中的位置。兩種方`結(jié)果一致，熒光集中分布在胞質(zhì)近胞膜，細(xì)胞核內(nèi)無熒光。通過熒光在細(xì)胞中的分布將重組NA蛋白表達(dá)定位在細(xì)胞膜上。
　　 4.神經(jīng)氨酸酶抗病活性的研究。構(gòu)建的真核表達(dá)載體pcDNA3.0-NA，用PEI