鈣池操縱的鈣內(nèi)流在膠質(zhì)瘤侵襲遷移中的作用.pdf

1、研究目的：
　　膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)最常見的腫瘤，其中膠質(zhì)母細胞瘤(glioblastoma multiforme,GBM)惡性度最高，預(yù)后最差。膠質(zhì)瘤浸潤性生長的生物學(xué)特性使得手術(shù)不可能完全切除全部的腫瘤細胞，殘存的腫瘤細胞對輔助放化療的抵抗并繼續(xù)在腦組織內(nèi)侵襲遷移是膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)及在CNS內(nèi)播散的主要根源。鈣離子作為細胞內(nèi)第二信使，介導(dǎo)多種信號通路，參與調(diào)控細胞運動。最近研究

2、發(fā)現(xiàn)，鈣信號與惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)。鈣池操縱的鈣內(nèi)流(store-operatedCa2+entry,SOCE)由基質(zhì)相互作用分子1(stromal interaction molecule1,STIM1)與鈣釋放激活的鈣通道蛋白1(Ca2+release-activated calcium channel protein1,Orai1)介導(dǎo)，是非興奮細胞內(nèi)鈣的來源途徑之一。本研究擬探討SOCE及其相關(guān)蛋白在膠質(zhì)瘤侵襲遷移中的作用及

3、機制，為膠質(zhì)瘤的抗侵襲遷移治療尋找新的靶點。
　　研究方法：
　　利用免疫組化、western blot檢測人腦膠質(zhì)瘤手術(shù)標本及膠質(zhì)瘤細胞系中STIM1與Orai1的表達特征。為研究SOCE在膠質(zhì)瘤細胞侵襲遷移過程中的作用，采用兩種方式阻斷SOCE：應(yīng)用藥理學(xué)抑制劑 SKF96365干預(yù)或者RNA干擾敲低膠質(zhì)瘤細胞中SOCE組成蛋白Orai1的表達；另外，為行恢復(fù)實驗，在Orai1沉默的腫瘤細胞中重新表達目的蛋白。應(yīng)用wes

4、tern blot、qRT-PCR驗證Orai1敲低或重新表達的情況；應(yīng)用Fluo-4/AM鈣熒光指示劑法檢測腫瘤細胞中SOCE的幅度變化；通過劃痕實驗、Transwell侵襲實驗觀察SOCE對膠質(zhì)瘤細胞侵襲遷移能力的影響。通過黏著斑蛋白vinculin免疫熒光染色觀察不同組別腫瘤細胞中黏著斑的位置、數(shù)目及大??；應(yīng)用western blot檢測E-cadherin、N-cadherin、vimentin的表達，觀察SOCE對膠質(zhì)瘤細胞中

5、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)樣改變的影響；應(yīng)用western blot檢測鈣依賴性富含脯氨酸的酪氨酸激酶2(proline-rich tyrosine kinase2，Pyk2)的總量及磷酸化的量，分析其活化程度。通過RNA干擾敲低Pyk2的表達，進一步研究SOCE是否是通過下游Pyk2信號通路發(fā)揮作用。應(yīng)用SKF96365或者RNA干擾敲低C6膠質(zhì)瘤細胞中Orai1的

6、表達，研究SOCE對C6膠質(zhì)瘤細胞體內(nèi)外侵襲遷移能力的影響。
　　研究結(jié)果：
　　SOCE相關(guān)蛋白STIM1在非腫瘤性對照腦組織及各級別膠質(zhì)瘤中均呈現(xiàn)低表達；而Orai1在對照腦組織中呈現(xiàn)低表達，在膠質(zhì)瘤細胞系和膠質(zhì)瘤標本中表達上調(diào)，且與腫瘤病理級別呈正相關(guān)。針對Orai1的RNA干擾能夠不同程度抑制U251、SNB19膠質(zhì)瘤細胞中SOCE的幅度。SKF96365及Orai1沉默能夠抑制膠質(zhì)瘤細胞的遷移及侵襲能力。與對照組相

7、比，SKF96365處理組及Orai1沉默組細胞外周區(qū)域黏著斑的面積增大；同時，E-cadherin的表達升高，而N-cadherin、vimentin的表達降低。Pyk2活性分析提示SOCE受到抑制后，Pyk2總量不變而磷酸化Pyk2的表達降低。然而，Orai1重新表達均能夠逆轉(zhuǎn)Orai1沉默所引起的上述變化。Pyk2沉默能夠抑制膠質(zhì)瘤細胞的侵襲能力。Pyk2沉默組細胞外周區(qū)域黏著斑的面積增大；同時，E-cadherin的表達升高，而

8、N-cadherin、vimentin的表達降低。SKF96365及Orai1沉默能夠抑制C6細胞在體外的侵襲遷移能力。Orai1沉默能夠抑制 C6細胞在大鼠顱內(nèi)的侵襲遷移，并抑制腫瘤細胞向血管旁聚集形成腫瘤小生境。
　　結(jié)論：
　　SOCE通過調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤細胞中Pyk2的活性，繼而調(diào)節(jié)細胞黏著斑周轉(zhuǎn)的速度及EMT樣改變，參與膠質(zhì)瘤的侵襲遷移惡性生物學(xué)行為。下調(diào)SOCE能夠抑制膠質(zhì)瘤細胞在體內(nèi)外的侵襲遷移，Orai1可能會成為