分泌型人Klotho基因酵母雙雜交誘餌載體的構建及其毒性與自激活效應檢測.pdf

1、Klotho參與人和動物的衰老過程的調控,一直是衰老研究中的熱點問題,但是klotho調控衰老的具體的分子信號機制,卻仍然沒有得到闡明。目前認為類似激素的klotho可能是起調節(jié)衰老作用的主要形式,為了深入研究klotho調控衰老的分子細胞機制,有必要弄清到底是哪一種形式的klotho起關鍵作用,我們從分泌型klotho入手,擬采用酵母雙雜交系統(tǒng)來篩選與之相互作用的蛋白,并進一步分析它如何調控下游靶基因及相關信號通路。
　　運用P

2、CR方法從pcDNA3.1-KL(secreted)質粒中擴增5’端高GC含量的分泌型人Klotho基因片段(hsKL),并克隆入pMD18-T載體,測序鑒定發(fā)現(xiàn),除了兩個無義突變外,序列正確。將相應片段克隆入酵母雙雜交載體pGBKT7中。鑒定序列正確后,用醋酸鋰法轉化酵母菌AH109,在營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基上觀察轉化菌株的生長狀況,檢測誘餌蛋白對酵母AH109有無細胞毒性及對報告基因有無激活作用。結果發(fā)現(xiàn),pGBKT7-hsKL轉化酵母感