人SARP1基因酵母雙雜交誘餌載體的構(gòu)建、表達(dá)鑒定及自激活和毒性檢測(cè).pdf

1、目的：構(gòu)建人SARP1基因酵母雙雜交誘餌載體，為鑒定SARP1基因相互作用蛋白、探討SARP1基因在瘢痕組織中的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：根據(jù)genebank中查到的SARP1的mRNA序列，設(shè)計(jì)分別帶有NdeⅠ和SalⅠ酶切位點(diǎn)的上、下游引物，人工合成SARP1基因片段，選擇pTA2作為克隆載體，擴(kuò)增SARP1基因片段，用NdeⅠ和SalⅠ分別雙酶切pTA2-SARP1 PCR產(chǎn)物和pGBKT7載體，膠回收后對(duì)二者進(jìn)行

2、連接，構(gòu)建含pGBKT7-SARP1基因的重組質(zhì)粒。以重組質(zhì)粒pGBKT7-SARP1轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，卡那霉素篩選陽(yáng)性克隆，分別對(duì)挑選的陽(yáng)性克隆用NdeⅠ和SalⅠ進(jìn)行雙酶切、凝膠電泳及測(cè)序，以鑒定重組質(zhì)粒pGBKT7-SARP1中插入的SARP1序列的完整性和可靠性。根據(jù)Clontech公司的酵母雜交操作手冊(cè)，用醋酸鋰法（Li-Ac）將序列正確的重組質(zhì)粒pGBKT7-SARP1轉(zhuǎn)化入AH109酵母菌株，在缺陷性培

3、養(yǎng)基上觀察pGBKT7-SARP1在AH109中的表達(dá)情況，檢測(cè)誘餌載體有無(wú)毒性作用和自激活效應(yīng)。
　　 結(jié)果：酶切后凝膠電泳及DNA測(cè)序證實(shí)pGBKT7-SARP1基因重組載體構(gòu)建正確，對(duì)酵母菌株AH109無(wú)毒性，且不具自主激活報(bào)告基因的效應(yīng)。
　　 結(jié)論：成功構(gòu)建了pGBKT7-SARP1基因重組酵母雙雜交誘餌載體，為進(jìn)一步用酵母雙雜交方法鑒定SARP1基因相互作用蛋白、探討SARP1基因在瘢痕成纖維細(xì)胞生物學(xué)功能奠