14-3-3ζ結(jié)合aPKC-ι經(jīng)上皮-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化促進(jìn)膽管癌侵襲轉(zhuǎn)移.pdf

1、第一部分、14-3-3ζ和aPKC-ι在膽管癌組織中表達(dá)及其與臨床預(yù)后的關(guān)系
　　目的：檢測(cè)14-3-3ζ和aPKC-ι在膽管癌組織中的表達(dá)，明確二者間的相互關(guān)系，并進(jìn)一步探討二者的表達(dá)與膽管癌臨床病理特征的相關(guān)性。
　　方法：運(yùn)用免疫組織化學(xué)（IHC）、實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）和免疫印跡法（WB）的方法檢測(cè)64例臨床膽管癌患者的手術(shù)標(biāo)本中14-3-3ζ、aPKC-ι和E-cadherin在癌組織與癌旁組織的差

2、異表達(dá)，另外，取10例膽管囊腫組織做陰性對(duì)照?？ǚ綑z驗(yàn)和t檢驗(yàn)檢測(cè)14-3-3ζ和aPKC-ι與膽管癌病理分化和TNM分期的關(guān)系；Spearman相關(guān)性分析法分析二者之間相關(guān)性；Kaplan-Meier法計(jì)算二者的表達(dá)與膽管癌患者總體生存得關(guān)系；Cox多因素回歸分析分析膽管癌患者預(yù)后獨(dú)立影響因素。
　　結(jié)果：在mRNA和蛋白質(zhì)水平，14-3-3ζ在膽管癌組織中顯著高表達(dá)，在癌旁組織和癌旁組織呈低表達(dá)；14-3-3ζ和 aPKC-ι

3、在膽管癌組織中協(xié)同高表達(dá)，二者呈正相關(guān)，并且與E-cadherin表達(dá)相反；14-3-3ζ和aPKC-ι二者的高表達(dá)與膽管癌的病理分化和TNM分期密切相關(guān)，二者共同低表達(dá)的患者總體生存時(shí)間較共同高表達(dá)者或單一低表達(dá)者生存時(shí)間長(zhǎng)，Cox多因素回歸分析14-3-3ζ是膽管癌預(yù)后的獨(dú)立影響因素。
　　結(jié)論：14-3-3ζ和 aPKC-ι協(xié)同促進(jìn)膽管癌的發(fā)生、發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移，14-3-3ζ是膽管癌預(yù)后的獨(dú)立影響因素，可作為預(yù)測(cè)膽管癌預(yù)后的

4、指標(biāo)。
　　第二部分、14-3-3ζ與aPKC-ι結(jié)合并相互調(diào)節(jié)
　　目的：在第一部分研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步明確14-3-3ζ與aPKC-ι之間的相互關(guān)系。
　　方法：通過(guò)CO-IP實(shí)驗(yàn)初步檢測(cè)14-3-3ζ與aPKC-ι是否存在特異性的直接結(jié)合關(guān)系。并運(yùn)用小分子干擾技術(shù)，合成14-3-3ζ-siRNA，aPKC-ι-siRNA和aPKC-ι過(guò)表達(dá)載體，構(gòu)建穩(wěn)定的14-3-3ζ低表達(dá)、aPKC-ι低表達(dá)和aPKC-ι高表達(dá)人

5、膽管癌細(xì)胞系。通過(guò)qRT-PCR、WB和IF檢測(cè)靶向沉默14-3-3ζ或aPKC-ι以及aPKC-ι-siRNA拯救實(shí)驗(yàn)中，相應(yīng)aPKC-ι或14-3-3ζ的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：CO-IP結(jié)果提示，經(jīng)14-3-3ζ與aPKC-ι抗體沉淀的人膽管癌組織和細(xì)胞蛋白中，WB可檢測(cè)出相應(yīng)的aPKC-ι和14-3-3ζ蛋白條帶；在體外，靶向沉默人膽管癌細(xì)胞中14-3-3ζ或aPKC-ι表達(dá)后，相應(yīng)的出現(xiàn)aPKC-ι或14-3-3ζ表達(dá)下降

6、現(xiàn)象；并且在aPKC-ι-siRNA拯救實(shí)驗(yàn)中，伴隨著aPKC-ι表達(dá)恢復(fù)的同時(shí)，14-3-3ζ表達(dá)亦出現(xiàn)升高。
　　結(jié)論：在人膽管癌中，14-3-3ζ與aPKC-ι存在特異性的直接結(jié)合關(guān)系，并且二者通過(guò)結(jié)合而互相調(diào)節(jié)。
　　第三部分、14-3-3ζ-aPKC-ι復(fù)合物促進(jìn)膽管癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化
　　目的：進(jìn)一步探討14-3-3ζ對(duì)人膽管癌細(xì)胞EMT轉(zhuǎn)化的調(diào)控機(jī)制。
　　方法：通過(guò)TGF-β1誘導(dǎo)構(gòu)建人膽管

7、癌細(xì)胞EMT體外模型，并運(yùn)用小分子干擾技術(shù)和siRNA拯救實(shí)驗(yàn)，靶向調(diào)控膽管癌14-3-3ζ和aPKC-ι的表達(dá)，通過(guò)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，以及qRT-PCR、WB和IF檢測(cè)EMT表型標(biāo)志物。
　　結(jié)果：通過(guò)TGF-β1誘導(dǎo)構(gòu)建人膽管癌細(xì)胞EMT體外模型，檢測(cè)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化有短梭形或三角形以及多邊形變?yōu)榧?xì)長(zhǎng)的纖維狀或長(zhǎng)梭形；EMT標(biāo)志物：上皮樣表型E-cadherin和β-catenin表達(dá)減少，而間質(zhì)樣表型N-cadheri

8、n和Vimentin表達(dá)增多；以及transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞EMT轉(zhuǎn)化后細(xì)胞侵襲移動(dòng)能力增強(qiáng)。然后當(dāng)靶向沉默人膽管癌細(xì)胞中14-3-3ζ或 aPKC-ι的表達(dá)，TGF-β1刺激引起轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)長(zhǎng)的纖維狀或長(zhǎng)梭形的細(xì)胞數(shù)目減少，EMT標(biāo)志物無(wú)明顯變化。另外，aPKC-ι-siRNA拯救實(shí)驗(yàn)提示，伴隨aPKC-ι的表達(dá)恢復(fù)，14-3-3ζ的表達(dá)亦得以升高，同時(shí)EMT標(biāo)志物的變化再次出現(xiàn)典型的EMT轉(zhuǎn)化表型標(biāo)志物變化。
　　結(jié)論：在

9、體外，14-3-3ζ通過(guò)與aPKC-ι結(jié)合形成復(fù)合物，促進(jìn)人膽管癌細(xì)胞EMT轉(zhuǎn)化。
　　第四部分、靶向沉默14-3-3ζ在體內(nèi)外抑制膽管癌侵襲轉(zhuǎn)移及增殖
　　目的：通過(guò)體外、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證靶向沉默14-3-3ζ對(duì)膽管癌增殖和轉(zhuǎn)移的作用。
　　方法：通過(guò)Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)和克隆平板實(shí)驗(yàn)體外驗(yàn)證靶向沉默14-3-3ζ對(duì)膽管癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移作用；通過(guò)裸鼠皮下移植瘤實(shí)驗(yàn)、肺轉(zhuǎn)移模型的構(gòu)建，并且皮下移植瘤和肺轉(zhuǎn)

10、移瘤行HE染色、IHC染色檢測(cè)，以及皮下移植瘤行qRT-PCR和WB檢測(cè)，體內(nèi)驗(yàn)證靶向沉默14-3-3ζ對(duì)膽管癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移作用。
　　結(jié)果：在體外，靶向沉默14-3-3ζ后，Transwell侵襲試驗(yàn)中膽管癌細(xì)胞穿透基底膜的細(xì)胞數(shù)目減少；劃痕實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞移動(dòng)的速率下降；克隆平板實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞克隆數(shù)目減少。在體內(nèi)，靶向沉默14-3-3ζ后，皮下移植瘤成瘤能力顯著下降；而肺轉(zhuǎn)移瘤的數(shù)目亦顯著減少；經(jīng)IHC、qRT-PCR和WB檢測(cè)證實(shí)