aPKC-ι調(diào)控膽管癌細(xì)胞EMT及化療抵抗作用中的機(jī)制研究.pdf

1、第一部分、aPKC-ι和E-Cadherin在膽管癌組織中的表達(dá)及與預(yù)后的相關(guān)性研究
　　目的：檢測aPKC-ι和E-Cadherin在膽管癌組織中的表達(dá)，并探討兩者的表達(dá)與膽管癌患者臨床預(yù)后的關(guān)系。
　　方法：選取自2008年1月到2013年6月期間華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院膽胰外科64例經(jīng)手術(shù)切除及經(jīng)病理證實(shí)的膽管癌組織及10例膽總管囊腫病人膽管組織標(biāo)本為研究對象。采用免疫組化（IHC）、實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（q

2、RT-PCR）、免疫印跡法（Western blot）方法檢測上述組織標(biāo)本中aPKC-ι、E-Cadherin基因和蛋白的差異表達(dá)情況。采用卡方檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)檢測aPKC-ι和E-Cadherin的表達(dá)與臨床病理分化和TNM分期的關(guān)系，采用Cox多因素回歸分析膽管癌患者預(yù)后獨(dú)立影響因素。
　　結(jié)果：aPKC-ι在51.56％的膽管癌組織中呈高表達(dá)（33/64），在76.56%的癌旁組織中呈低表達(dá)（49/64），而正常組織中低表達(dá)則占

3、100%（10/10）。aPKC-ι在膽管癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織（χ2=10.8,P=0.001）、正常組織（χ2=9.306,P=0.002）。E-cadherin在67.2%的膽管癌組織中呈低表達(dá)（43/64），在32.8%的癌旁組織（21/64）和90%的正常組織（9/10）中呈高表達(dá)。E-cadherin在膽管癌組織中的表達(dá)明顯低于癌旁組織（χ2=16.949,P<0.001）、正常組織（χ2=10.614,P<0.00

4、1）。aPKC-ι的表達(dá)水平與膽管癌分化程度呈負(fù)相關(guān)（χ2=9.002，P=0.003），與膽管癌TNM分期密切相關(guān)，呈正相關(guān)（χ2=7.000,P=0.008）。E-cadherin的表達(dá)水平與膽管癌分化程度呈正相關(guān)（χ2=6.585，P＜0.001），與膽管癌TNM分期呈負(fù)相關(guān)（χ2=5.505,P＜0.001）。Cox多因素回歸分析顯示，腫瘤分化程度、TNM分期、aPKC-ι及E-cadherin表達(dá)水平是影響膽管癌患者預(yù)后的獨(dú)立

5、因素。
　　結(jié)論：aPKC-ι和E-Cadherin的表達(dá)水平與膽管癌的分化程度、TNM分期及預(yù)后密切相關(guān)，并且是膽管癌患者的獨(dú)立預(yù)后因素。
　　第二部分、aPKC-ι通過Snai1調(diào)節(jié)膽管癌細(xì)胞EMT
　　目的：研究aPKC-ι調(diào)控膽管癌細(xì)胞EMT過程中的分子機(jī)制。
　　方法：體外傳代培養(yǎng)膽管癌細(xì)胞系TFK-1至對數(shù)期。合成攜帶aPKC-ι低表達(dá)(aPKC-ι-siRNA)、aPKC-ι過表達(dá)(aPKC-ι-s

6、aRNA)的慢病毒包裝質(zhì)粒，并構(gòu)建穩(wěn)定aPKC-ι低表達(dá)TFK-1細(xì)胞（aPKC-ι-siRNA-TFK-1）、aPKC-ι過表達(dá)TFK-1細(xì)胞（aPKC-ι-saRNA-TFK-1）。實(shí)驗(yàn)設(shè)置空白對照組（Blank）及陰性對照組（Control），并采用qRT-PCR、Western Blot檢測不同實(shí)驗(yàn)組aPKC-ι、E-cadherin、Vimentin、Snai1、Snai2表達(dá)情況。為進(jìn)一步檢測aPKC-ι調(diào)節(jié)EMT過程中的關(guān)

7、鍵作用靶點(diǎn)，選取aPKC-ι過表達(dá)組TFK-1（aPKC-ι-saRNA-TFK-1）細(xì)胞，運(yùn)用Si-RNA技術(shù)靶向下調(diào)Snai1表達(dá)，設(shè)置空白對照組（Blank），采用qRT-PCR、Western Blot檢測不同實(shí)驗(yàn)組aPKC-ι、E-cadherin、Vimentin、Snai1表達(dá)情況。
　　結(jié)果：和Blank、Control組比較，伴隨著aPKC-ι的表達(dá)下調(diào)，aPKC-ι-siRNA-TFK-1細(xì)胞中的E-cadhe

8、rin表達(dá)量明顯增高，Vimentin表達(dá)量則顯著降低，Snai1的表達(dá)量出現(xiàn)下降；而aPKC-ι過表達(dá)的aPKC-ι-saRNA-TFK-1細(xì)胞中上述標(biāo)志物的表達(dá)情況則正好相反。各個(gè)實(shí)驗(yàn)組中Snai2的表達(dá)量則無明顯變化。aPKC-ι-saRNA-TFK-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染Si-Snai1后，和對照組相比，實(shí)驗(yàn)組aPKC-ι表達(dá)無差異，伴隨著Snai1的表達(dá)量下降，其E-cadherin表達(dá)量出現(xiàn)升高，Vimentin表達(dá)量則出現(xiàn)下降。

9、>　　結(jié)論：aPKC-ι是調(diào)節(jié)膽管癌EMT過程中的關(guān)鍵分子，并且該調(diào)節(jié)作用是依賴于轉(zhuǎn)錄因子Snai1的介導(dǎo)作用來完成的。
　　第三部分、aPKC-ι調(diào)節(jié)膽管癌細(xì)胞化療抵抗作用中的機(jī)制研究
　　目的：研究aPKC-ι調(diào)控膽管癌細(xì)胞化療抵抗作用中的機(jī)制。
　　方法：體外傳代培養(yǎng)膽管癌細(xì)胞系 TFK-1至對數(shù)期。選取 Blank、aPKC-ι-siRNA-TFK-1、aPKC-ι-saRNA-TFK-1細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對象，分別使

10、用不同濃度吉西他濱（0.1μg/ml、1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml）、順鉑（1μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、50μg/ml）作用于上述細(xì)胞，采用CCK-8方法檢測不同實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞在藥物作用12h、24h、48h、72h的細(xì)胞生存率，并計(jì)算不同實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的IC50值。采用流式細(xì)胞學(xué)方法檢測不同實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞在不同藥物最佳濃度作用后細(xì)胞的凋亡情況。最后采用Western blot檢測上述實(shí)驗(yàn)中藥物抵抗蛋白P-gp、凋亡

11、蛋白Caspase3的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：CCK-8檢測結(jié)果顯示，吉西他濱、順鉑對細(xì)胞的增殖抑制作用具有濃度及時(shí)間依賴性，隨著藥物作用濃度的增加和作用時(shí)間的延長，三種細(xì)胞的生存率均出現(xiàn)不同程度的下降。其中，aPKC-ι-siRNA-TFK-1細(xì)胞的下降程度最為明顯。Blank、aPKC-ι-siRNA-TFK-1、aPKC-ι-saRNA-TFK-1細(xì)胞對吉西他濱的IC50值分別為1.52μg/ml、0.56μg/ml、2.78

12、μg/ml（P＜0.001），對順鉑的IC50值則分別為9.3μg/ml、5.7μg/ml、16.3μg/ml（P＜0.001）。流式細(xì)胞學(xué)檢測結(jié)果表明，藥物對aPKC-ι-siRNA-TFK-1細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用最為明顯，而aPKC-ι-saRNA-TFK-1細(xì)胞則未見明顯凋亡。Western blot結(jié)果顯示，aPKC-ι-siRNA-TFK-1細(xì)胞中藥物抵抗蛋白P-gp的表達(dá)量較對照組明顯下降，藥物作用后凋亡蛋白 Caspase3