Mfn2對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7侵襲遷移能力的影響及機(jī)制探究.pdf

1、目的:
　　通過(guò)沉默乳腺癌細(xì)胞MCF-7中的Mfn2（Mitochondria fusin-2）基因，觀察其對(duì)細(xì)胞侵襲、遷移能力的影響，并探討其作用機(jī)制是否與MMP-2（Matzix metalloproteinase2）相關(guān)，為將Mfn2基因作為乳腺癌治療的新靶點(diǎn)用于臨床奠定理論基礎(chǔ)。
　　方法用Western blot方法比較弱侵襲力乳腺癌細(xì)胞 MCF-7和強(qiáng)侵襲力乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231中Mfn2的表達(dá)水平。設(shè)計(jì)

2、針對(duì)Mfn2基因的siRNA，利用轉(zhuǎn)染試劑-脂質(zhì)體Lipofectamine2000包裹Mfn2-siRNA，將其導(dǎo)入乳腺癌細(xì)胞MCF-7中，以沉默目的基因 Mfn2（實(shí)驗(yàn)組），同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照組（轉(zhuǎn)染無(wú)意義序列組）和空白對(duì)照組（未轉(zhuǎn)染組）。用帶熒光染料的陰性對(duì)照組摸索最佳轉(zhuǎn)染條件。采用qRT-PCR(real-time fluorescent quantitative,PCR）方法在RNA水平上檢測(cè)Mfn2基因沉默效果。分別用免疫細(xì)胞

3、化學(xué)和Western blot方法檢測(cè)Mfn2的表達(dá)水平。采用Transwell實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)分析比較三組中MCF-7細(xì)胞的侵襲力和遷移力的異同。采用免疫細(xì)胞化學(xué)和Western blot法，在蛋白水平上檢測(cè)三組細(xì)胞中MMP-2的表達(dá)量。
　　結(jié)果弱侵襲力細(xì)胞MCF-7中Mfn2表達(dá)水平高于強(qiáng)侵襲力細(xì)胞MDA-MB-231，兩組間有顯著性差異（P＜0.05）。利用帶熒光染料的陰性對(duì)照序列找到最佳轉(zhuǎn)染條件，轉(zhuǎn)染試劑為2μl的FAM-

4、siRNA對(duì)應(yīng)1μl的Lipofectamine2000，轉(zhuǎn)染效率可高達(dá)85％；應(yīng)用qRT-PCR法結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組，陰性對(duì)照組，空白對(duì)照組中Mfn2的mRNA的相對(duì)水平分別是（0.27±0.03），（0.97±0.01），（1.00±0.00）；實(shí)驗(yàn)組中 Mfn2的mRNA水平低于兩對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=2074.682，P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)組中目的基因 Mfn2的沉默效率可高達(dá)75%。免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果經(jīng)IPP軟件分析顯示：實(shí)

5、驗(yàn)組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組 Mfn2蛋白的表達(dá)水平分別為（335331.67±7216.089）、（637438.67±30060.641）和（673956.67±25132.255）；實(shí)驗(yàn)組的Mfn2蛋白水平低于兩對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=138.831，P＜0.05）；兩對(duì)照組間無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組中 Mfn2的相對(duì)表達(dá)水平（OD, relative

6、 optical density）分別為（0.474019±0.0059504）、（1.144936±0.0256883）和（1.093283±0.0584572）；實(shí)驗(yàn)組Mfn2的表達(dá)量低于兩對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=70.312，P＜0.05）；兩對(duì)照組間無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。以上結(jié)果提示，siRNA有效沉默了 MCF-7細(xì)胞內(nèi) Mfn2基因，導(dǎo)致其mRNA和蛋白水平顯著降低。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：劃痕24h后，實(shí)驗(yàn)組、陰性

7、對(duì)照組和空白對(duì)照組的細(xì)胞遷移率分別為（0.1774±0.0065）%、（0.0715±0.0053）%和（0.0649±0.0046）%；實(shí)驗(yàn)組的24h細(xì)胞遷移率高于兩對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=392.782，P＜0.05）；兩對(duì)照組間無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。劃痕48h后，實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組的細(xì)胞遷移率分別為（0.3200±0.0100）%、（0.1162±0.0054）%和（0.0660±0.0037）%；實(shí)驗(yàn)組

8、的48h細(xì)胞遷移率高于兩對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1141.329，P＜0.05）；兩對(duì)照組間無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組的侵出小室細(xì)胞數(shù)分別為（900.330±50.501）、（440.000±26.458）和（460.000±20.000）；實(shí)驗(yàn)組侵出小室細(xì)胞數(shù)高于兩對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=166.916，P＜0.05），兩對(duì)照組間無(wú)顯著性差異（P＞0.05）

9、。免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組中 MMP-2蛋白的表達(dá)水平分別為（630055.33±26745.600）、（432000.00±8544.044）和（437837.68±5860.727）；實(shí)驗(yàn)組的MMP-2蛋白水平高于兩對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1291.687，P＜0.05）；兩對(duì)照組間無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組中 MMP-2的相對(duì)

10、值（OD）分別為（1.0067±0.00452）、（0.4507±0.01867）和（0.4334±0.01736）。實(shí)驗(yàn)組 MMP-2的表達(dá)量高于兩對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=23.832，P＜0.05）；兩對(duì)照組間MMP-2表達(dá)量無(wú)顯著差別（P＞0.05）。
　　結(jié)論:
　　1.Mfn2基因表達(dá)水平的降低可導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞MCF-7的侵襲、遷移能力增強(qiáng)。
　　2.Mfn2基因可能通過(guò)調(diào)控MMP-2的表達(dá)影響MCF-