Mfn2對乳腺癌細胞MCF-7侵襲遷移能力的影響及機制探究.pdf

1、目的:
　　通過沉默乳腺癌細胞MCF-7中的Mfn2（Mitochondria fusin-2）基因，觀察其對細胞侵襲、遷移能力的影響，并探討其作用機制是否與MMP-2（Matzix metalloproteinase2）相關(guān)，為將Mfn2基因作為乳腺癌治療的新靶點用于臨床奠定理論基礎(chǔ)。
　　方法用Western blot方法比較弱侵襲力乳腺癌細胞 MCF-7和強侵襲力乳腺癌細胞MDA-MB-231中Mfn2的表達水平。設(shè)計

2、針對Mfn2基因的siRNA，利用轉(zhuǎn)染試劑-脂質(zhì)體Lipofectamine2000包裹Mfn2-siRNA，將其導(dǎo)入乳腺癌細胞MCF-7中，以沉默目的基因 Mfn2（實驗組），同時設(shè)立陰性對照組（轉(zhuǎn)染無意義序列組）和空白對照組（未轉(zhuǎn)染組）。用帶熒光染料的陰性對照組摸索最佳轉(zhuǎn)染條件。采用qRT-PCR(real-time fluorescent quantitative,PCR）方法在RNA水平上檢測Mfn2基因沉默效果。分別用免疫細胞

3、化學(xué)和Western blot方法檢測Mfn2的表達水平。采用Transwell實驗和劃痕實驗分析比較三組中MCF-7細胞的侵襲力和遷移力的異同。采用免疫細胞化學(xué)和Western blot法，在蛋白水平上檢測三組細胞中MMP-2的表達量。
　　結(jié)果弱侵襲力細胞MCF-7中Mfn2表達水平高于強侵襲力細胞MDA-MB-231，兩組間有顯著性差異（P＜0.05）。利用帶熒光染料的陰性對照序列找到最佳轉(zhuǎn)染條件，轉(zhuǎn)染試劑為2μl的FAM-

4、siRNA對應(yīng)1μl的Lipofectamine2000，轉(zhuǎn)染效率可高達85％；應(yīng)用qRT-PCR法結(jié)果顯示：實驗組，陰性對照組，空白對照組中Mfn2的mRNA的相對水平分別是（0.27±0.03），（0.97±0.01），（1.00±0.00）；實驗組中 Mfn2的mRNA水平低于兩對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=2074.682，P＜0.05）。實驗組中目的基因 Mfn2的沉默效率可高達75%。免疫細胞化學(xué)結(jié)果經(jīng)IPP軟件分析顯示：實

5、驗組、陰性對照組和空白對照組 Mfn2蛋白的表達水平分別為（335331.67±7216.089）、（637438.67±30060.641）和（673956.67±25132.255）；實驗組的Mfn2蛋白水平低于兩對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=138.831，P＜0.05）；兩對照組間無顯著性差異（P＞0.05）。Western blot實驗結(jié)果顯示：實驗組、陰性對照組和空白對照組中 Mfn2的相對表達水平（OD, relative

6、 optical density）分別為（0.474019±0.0059504）、（1.144936±0.0256883）和（1.093283±0.0584572）；實驗組Mfn2的表達量低于兩對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=70.312，P＜0.05）；兩對照組間無顯著性差異（P＞0.05）。以上結(jié)果提示，siRNA有效沉默了 MCF-7細胞內(nèi) Mfn2基因，導(dǎo)致其mRNA和蛋白水平顯著降低。劃痕實驗結(jié)果顯示：劃痕24h后，實驗組、陰性

7、對照組和空白對照組的細胞遷移率分別為（0.1774±0.0065）%、（0.0715±0.0053）%和（0.0649±0.0046）%；實驗組的24h細胞遷移率高于兩對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=392.782，P＜0.05）；兩對照組間無顯著性差異（P＞0.05）。劃痕48h后，實驗組、陰性對照組和空白對照組的細胞遷移率分別為（0.3200±0.0100）%、（0.1162±0.0054）%和（0.0660±0.0037）%；實驗組

8、的48h細胞遷移率高于兩對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=1141.329，P＜0.05）；兩對照組間無顯著性差異（P＞0.05）。Transwell實驗結(jié)果顯示：實驗組、陰性對照組和空白對照組的侵出小室細胞數(shù)分別為（900.330±50.501）、（440.000±26.458）和（460.000±20.000）；實驗組侵出小室細胞數(shù)高于兩對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=166.916，P＜0.05），兩對照組間無顯著性差異（P＞0.05）

9、。免疫細胞化學(xué)結(jié)果顯示，實驗組、陰性對照組和空白對照組中 MMP-2蛋白的表達水平分別為（630055.33±26745.600）、（432000.00±8544.044）和（437837.68±5860.727）；實驗組的MMP-2蛋白水平高于兩對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=1291.687，P＜0.05）；兩對照組間無顯著性差異（P＞0.05）。Western blot實驗結(jié)果顯示：實驗組、陰性對照組和空白對照組中 MMP-2的相對

10、值（OD）分別為（1.0067±0.00452）、（0.4507±0.01867）和（0.4334±0.01736）。實驗組 MMP-2的表達量高于兩對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=23.832，P＜0.05）；兩對照組間MMP-2表達量無顯著差別（P＞0.05）。
　　結(jié)論:
　　1.Mfn2基因表達水平的降低可導(dǎo)致乳腺癌細胞MCF-7的侵襲、遷移能力增強。
　　2.Mfn2基因可能通過調(diào)控MMP-2的表達影響MCF-