母體血漿中胎兒游離mRNA等位基因比率分析——用于21三體綜合征無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前篩查的研究.pdf

1、21三體綜合征是常見(jiàn)的染色體非整倍疾病之一，主要臨床表現(xiàn)為智力低下，多器官發(fā)育及功能異常，典型的面部特征等。其產(chǎn)前篩查及診斷作為產(chǎn)科醫(yī)務(wù)工作者的重點(diǎn)研究?jī)?nèi)容。目前染色體核型分析技術(shù)仍然是產(chǎn)前診斷21－三體綜合征胎兒的金標(biāo)準(zhǔn)[1]，但需要采用有創(chuàng)傷性的方法獲取胎兒細(xì)胞，如羊水穿刺、臍血穿刺或者獲取絨毛組織，給孕婦及家屬帶來(lái)很多顧慮，不易被接受。近年來(lái)研究顯示[2-4]，母體外周血中存在胎兒游離核酸，這為無(wú)創(chuàng)性篩查胎兒染色體非整倍體異常提供

2、了新途徑。Poon等[5]研究發(fā)現(xiàn)，孕婦外周血血漿中來(lái)源于胎盤(pán)的胎兒特異性表達(dá)的PLAC4基因所編碼的mRNA，為胎兒游離mRNA用于無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前篩查21三體綜合征提供了依據(jù)。MLPA-SNP技術(shù)是近年來(lái)產(chǎn)前篩查21三體綜合征的新技術(shù)[6]，運(yùn)用母體外周血中胎兒特異的mRNA上的等位基因的多態(tài)性，對(duì)21三體綜合征進(jìn)行產(chǎn)前篩查。本研究通過(guò)DNA測(cè)序技術(shù)及PCR-RFLP技術(shù)，分析河南地區(qū)漢族人群21號(hào)染色體上PLAC4和COL6A2基因的10

3、個(gè)SNP位點(diǎn)的基因型，篩選適合本地區(qū)人群的高雜合率SNP位點(diǎn)；檢測(cè)孕8-16周孕婦外周血中的胎兒特異基因PLAC4和COL6A2 mRNA的表達(dá)量，分析無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前篩查的適宜孕周；選取該地區(qū)5個(gè)高雜合率SNP位點(diǎn)，采用RT-MLPA技術(shù)對(duì)40例標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。
　　目的：
　　本研究通過(guò)分析中國(guó)河南地區(qū)漢族人群中21號(hào)染色體上PLAC4和COL6A2基因的多個(gè)單核苷酸多態(tài)性的特點(diǎn)，及胎兒游離mRNA在不同孕周的母體外周血中的表達(dá)

4、水平。探討逆轉(zhuǎn)錄-多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)用于該地區(qū)21三體綜合征胎兒的無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前篩查的價(jià)值。
　　材料和方法：
　　1.實(shí)驗(yàn)材料
　?、俚谝徊糠郑弘S機(jī)選取2013年6月至12月在鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院體檢門(mén)診體檢的患者500例，男女各250例，滿(mǎn)足條件：籍貫河南省，漢族，既往體健，簽署知情同意書(shū)后，留取其2mL外周靜脈血置于EDTA抗凝管作為標(biāo)本。
　　②第二部分：隨機(jī)選取門(mén)診30例圍產(chǎn)保健的健康孕婦，簽署知情同意書(shū)

5、后，分別在其懷孕8周、10周、12周、14周、16周，留取5mL外周靜脈血置于EDTA抗凝管作為標(biāo)本。
　?、鄣谌糠郑哼x取我院羊水胎兒細(xì)胞染色體核型分析結(jié)果為21三體綜合征陽(yáng)性的孕婦20例為實(shí)驗(yàn)組，正常妊娠孕婦20例作為陰性對(duì)照組，告知并簽署知情同意書(shū)后，留取其5mL外周靜脈血置于EDTA抗凝管作為標(biāo)本。
　　2.實(shí)驗(yàn)方法
　　①第一部分：運(yùn)用聚合酶鏈反應(yīng)－限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)和DNA測(cè)序技術(shù)，檢測(cè)500例河南地

6、區(qū)漢族人群中胎兒特異性基因PLAC4和COL6A2基因上10個(gè)SNP位點(diǎn)的基因型，計(jì)算其等位基因的雜合率；
　?、诘诙糠郑哼\(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)，測(cè)定30例孕婦在孕8周、10周、12周、14周、16周時(shí)的外周血中胎兒游離的PLAC4和COL6A2兩種mRNA在5個(gè)不同孕周期的表達(dá)水平；
　　③第三部分：運(yùn)用逆轉(zhuǎn)錄-多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)對(duì)羊水胎兒細(xì)胞染色體核型分析結(jié)果為21三體綜合征陽(yáng)性的孕婦20例及正常妊

7、娠孕婦20例，進(jìn)行21三體綜合征胎兒的無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前篩查。
　　結(jié)果：
　　1.第一部分500例河南地區(qū)漢族人群中胎兒特異性基因上10個(gè)SNP位點(diǎn)雜合率分別為
　　1）PLAC4基因：rs59066201（61.6％）、rs8130833（39.2%）、rs4818219（34.8%）、rs9977003（21.6%）、rs7844（19.2%）；
　　2）COL6A2基因：rs7717（49.6%）、rs10445

8、98（53.4%）、rs559（50.2%）、rs3088026（12.8%）、rs1042917（45.6%）：
　　3）rs59066201等位基因雜合率在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)上未見(jiàn)報(bào)道；與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)報(bào)道相比較，rs8130833、rs9977003、rs7844位點(diǎn)等位基因雜合率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），其他位點(diǎn)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。
　　2.第二部分30例孕婦在孕8周、10周、12周、14周、16周時(shí)的外周

9、血中均能檢測(cè)到胎兒游離mRNA，表達(dá)量隨孕周的增加而增加
　　1）PLAC4 mRNA在5個(gè)孕周的表達(dá)水平依次為：7.22±1.05、8.02±1.41、9.51±1.69、11.33±2.11、13.31±2.58；
　　2）COL6A2 mRNA在5個(gè)孕周的表達(dá)水平依次為8.95±1.28、11.19±1.36、15.0±1.58、16.87±1.72、18.96±2.79。
　　3.第三部分選取5個(gè)雜合率比較高的

10、SNP位點(diǎn)，采用RT-MLPA技術(shù)進(jìn)行21三體綜合征的產(chǎn)前篩查
　　rs7717、rs559、rs1044598、rs59066201、rs1042917，在河南地區(qū)人群覆蓋率達(dá)到[[1-（1-49.6%）×（1-53.4%）×（1-50.2%）×（1-61.6%）×（1-45.6%）]=97.6%]，對(duì)20例21三體綜合征胎兒孕婦及20例正常胎兒孕婦外周血標(biāo)本進(jìn)行21三體綜合征的無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前篩查，有效篩查率達(dá)到87.5%，篩查準(zhǔn)確

11、率達(dá)到100%。
　　結(jié)論：
　　1．本研究中的10個(gè)SNP位點(diǎn)中，rs7717、rs559、rs1044598、rs59066201、rs1042917位點(diǎn)的雜合率較高，人群覆蓋率達(dá)到97.6%，可用于河南地區(qū)漢族人群21三體綜合征的無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前篩查；
　　2．胎兒特異性基因PLAC4和COL6A2 mRNA在孕婦外周血中均有表達(dá)，當(dāng)胎兒特異性mRNA-SNP位點(diǎn)呈雜合狀態(tài)時(shí)，運(yùn)用RT-MLPA技術(shù)可以在孕8-16周進(jìn)