唐氏綜合征無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷及相關(guān)基因功能的研究.pdf

1、第—部分DSCR4用于唐氏綜合征無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷及其基因功能的初步研究
　　唐氏綜合征是最常見(jiàn)的先天性疾病,大多數(shù)患者有輕至中度的智力障礙,迄今尚無(wú)有效的治療方法。減少唐氏綜合征危害的根本辦法是采取積極的一級(jí)和二級(jí)預(yù)防措施,避免患兒出生。
　　目前唐氏綜合征的常規(guī)診斷方法主要是在孕中期血清學(xué)篩查的基礎(chǔ)上,對(duì)高危孕婦通過(guò)羊膜腔穿刺或絨毛膜取樣獲取細(xì)胞體外培養(yǎng)后進(jìn)行核型分析。這些方法周期長(zhǎng)、創(chuàng)傷大,胎兒丟失率約為1％,10％左右的

2、高危孕婦為此拒絕接受這些侵入性檢查。所以,尋找并建立早期、快速、準(zhǔn)確和無(wú)創(chuàng)性唐氏綜合征診斷方法,是亟待解決的關(guān)鍵臨床問(wèn)題,也是產(chǎn)前診斷的重要目標(biāo)之一。
　　無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷是指通過(guò)采取孕婦的外周血,獲得胎兒細(xì)胞或游離的胎兒核酸從而診斷胎兒的遺傳疾病。其中,孕婦外周血中游離的胎兒DNA含量相對(duì)豐富,是胎兒細(xì)胞的970倍,占孕婦總DNA的3.4％-6.2％,且比胎兒mRNA穩(wěn)定,采血24小時(shí)后含量幾乎無(wú)變化,更適用于無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷,但所

3、面臨的關(guān)鍵問(wèn)題是如何在孕婦外周血中區(qū)分出游離的胎兒DNA和母體DNA。
　　研究顯示,孕婦外周血中母體DNA主要來(lái)源于造血細(xì)胞,而游離的胎兒DNA主要來(lái)源于胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞。兩者的組織來(lái)源不同,造成某些DNA片段的甲基化水平存在相當(dāng)大的差異,這種差異可以作為區(qū)分母胎DNA的生物學(xué)標(biāo)志。有研究報(bào)道,位于染色體18q21.3上的SERPINB5基因啟動(dòng)子在孕婦白細(xì)胞中呈現(xiàn)高度甲基化而在胎盤(pán)組織中卻很少甲基化,可認(rèn)為非甲基化的SERPINB

4、5(U-SERPINB5)基因來(lái)源于胎兒。
　　為了尋找位于21號(hào)染色體上、在母胎之間存在甲基化差異的DNA片段,我們選取了21號(hào)染色體上6個(gè)基因——CGI137,LRRC3,POTE,COL6A1,AIRE和DSCR4。這些基因的mRNA都是胎盤(pán)特異性或高表達(dá)的,由此推測(cè)它們的啟動(dòng)子區(qū)域在胎盤(pán)組織中是低甲基化,而在母親外周血白細(xì)胞中是高甲基化的。
　　通過(guò)聯(lián)合甲基化敏感性限制性?xún)?nèi)切酶酶切和甲基化結(jié)合結(jié)構(gòu)域法,我們比較所選取

5、的6個(gè)基因啟動(dòng)子區(qū)域的DNA片段在早孕期和晚孕期的孕婦外周血白細(xì)胞DNA和胎盤(pán)組織DNA之間的甲基化差異,發(fā)現(xiàn)AIRE、POTE和DSCR4基因片段在早孕期的母胎之間有甲基化差異。
　　通過(guò)亞硫酸氫鹽處理后PCR克隆測(cè)序,我們檢測(cè)了所選基因片段內(nèi)每個(gè)CG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài),發(fā)現(xiàn)DSCR4基因片段的12個(gè)CG位點(diǎn)在母胎之間的甲基化差異最為顯著——在早孕期胎盤(pán)組織中呈低甲基化狀態(tài),而在相應(yīng)的孕婦外周血白細(xì)胞中則呈高度甲基化狀態(tài)。

6、　　為了排除克隆測(cè)序時(shí)的抽樣誤差,我們通過(guò)亞硫酸氫鹽聯(lián)合限制性?xún)?nèi)切酶分析法,證實(shí)所有亞硫酸氫鹽處理后DSCR4PCR產(chǎn)物中兩個(gè)位于酶切位點(diǎn)內(nèi)的CG位點(diǎn)確實(shí)存在如上所述的母胎甲基化差異。
　　根據(jù)亞硫酸氫鹽測(cè)序的結(jié)果,我們?cè)O(shè)計(jì)了DSCR4甲基化特異性PCR的引物,通過(guò)甲基化特異性PCR,我們證實(shí)非甲基化的DSCR4(U-DSCR4)只存在于胎盤(pán)組織中,針對(duì)U-DSCR4的引物擴(kuò)增效果好,無(wú)引物二聚體,可用熒光染料法(SYBRGree

7、nⅠ)進(jìn)行定量檢測(cè)。相對(duì)定量分析顯示,U-DSCR4只存在于早孕期孕婦外周血血漿,而不存在于白細(xì)胞中,是位于21號(hào)染色體上的胎兒表觀遺傳學(xué)標(biāo)志。
　　DSCR4(Down syndrome critical region gene 4)是唐氏綜合征關(guān)鍵區(qū)域內(nèi)的基因之一。DSCR4的mRNA只存在于胎盤(pán)組織和兩種人絨癌細(xì)胞系(JEG3、BeWo)中。唐氏綜合征胎兒由于染色體異常,所有的器官包括胎盤(pán)同樣可能受到影響,特別是對(duì)合體滋養(yǎng)層

8、的影響更大,導(dǎo)致胎盤(pán)產(chǎn)物生成異常,滋養(yǎng)層功能下降,多個(gè)唐氏血清學(xué)篩查標(biāo)志(PAPP-A、hCG等)即基于此原理。胎盤(pán)特異性表達(dá)的DSCR4基因在唐氏胎盤(pán)滋養(yǎng)層異常的發(fā)生中的功能因而成為我們的研究對(duì)象。
　　甲基化特異性PCR證實(shí)DSCR4啟動(dòng)子區(qū)域在JEG3和BeWo細(xì)胞中低甲基化,而在HEK293細(xì)胞中高甲基化,提示該基因的甲基化可能和基因表達(dá)有關(guān)。為了研究DSCR4基因功能,我們?cè)吮磉_(dá)了DSCR4全長(zhǎng)蛋白質(zhì),作為抗原免疫家兔

9、制備DSCR4的抗血清并通過(guò)蛋白A/G beads進(jìn)行親和純化。免疫印跡(Western blot,WB)證實(shí)純化后的抗血清特異性顯著改善。通過(guò)構(gòu)建綠色熒光蛋白DSCR4融合蛋白瞬時(shí)轉(zhuǎn)染BeWo細(xì)胞,檢測(cè)外源性DSCR4的亞細(xì)胞定位以及用自制的抗體直接檢測(cè)BeWo細(xì)胞內(nèi)源性DSCR4的細(xì)胞分布,并通過(guò)分別抽提BeWo和JEG3細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞漿蛋白,用抗體進(jìn)行WB都證實(shí)DSCR4定位在滋養(yǎng)細(xì)胞核內(nèi)。隨后,我們合成3個(gè)針對(duì)DSCR4 m

10、RNA的小干擾片段(siRNA),RT-PCR和WB證實(shí)2號(hào)小干擾片段對(duì)DSCR4的轉(zhuǎn)錄和翻譯有明顯的干擾效果。下調(diào)DSCR4可以抑制細(xì)胞的遷移和侵襲,但不影響細(xì)胞增殖。
　　第二部分唐氏綜合征相關(guān)微小RNA——microRNA-125b相關(guān)功能的研究
　　微小RNA(microRNA,miRNA)是生物體內(nèi)長(zhǎng)約17-25個(gè)核苷酸的非編碼小RNA。在細(xì)胞核內(nèi),編碼miRNA的基因最初轉(zhuǎn)錄生成pri-miRNA,經(jīng)過(guò)剪切生成6

11、0-100個(gè)堿基大小、具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的單鏈RNA前體(pre-miRNA),然后被轉(zhuǎn)入細(xì)胞質(zhì),在Dicer酶加工下形成miRNA成熟體,成熟體miRNA通過(guò)與靶mRNA間的互補(bǔ)配對(duì),導(dǎo)致靶mRNA的降解或翻譯抑制,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因的負(fù)調(diào)控。
　　唐氏綜合征患者伴發(fā)白血病的比例較高,所以研究唐氏綜合征相關(guān)miRNA在腫瘤中的作用也成為我們關(guān)注的對(duì)象,又因?yàn)槿橄侔┦潜緦?shí)驗(yàn)室的主要研究方向之一,我們選擇了乳腺癌為模型來(lái)研究唐氏綜合征相關(guān)m

12、iRNA在腫瘤中的作用。通過(guò)總RNA加尾后RT-PCR(poly A RT-PCR)分析了五個(gè)唐氏綜合征相關(guān)miRNA在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá),我們發(fā)現(xiàn)mir-125b在高侵襲性乳腺癌細(xì)胞中高表達(dá),這提示它可能參與乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。
　　在mir-125b高表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞中,下調(diào)mir-125b可以抑制細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移和增殖能力:相反,在低表達(dá)mir-125b的乳腺癌細(xì)胞中,上調(diào)mir-125b會(huì)增強(qiáng)細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移和增殖能力。我

13、們通過(guò)裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確認(rèn)下調(diào)mir-125b可導(dǎo)致肺轉(zhuǎn)移灶數(shù)目的減少。在尋找mir-125b的靶基因過(guò)程中,我們通過(guò)多種方法證明mir-125b可作用于一系列的抑癌基因,它們包括BDP1、P53、BAP1、BAK1和ST18,這也進(jìn)一步證明了mir-125b的癌基因活性,同時(shí)也發(fā)現(xiàn)mir-125b主要作用于BDP1的轉(zhuǎn)錄水平,對(duì)BAK1的轉(zhuǎn)錄水平稍有影響,而對(duì)P53、BAP1的轉(zhuǎn)錄水平影響不大。臨床樣本分析也顯示,與良性乳腺纖維腺瘤