唐氏綜合征無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷及相關基因功能的研究.pdf

1、第—部分DSCR4用于唐氏綜合征無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷及其基因功能的初步研究
　　唐氏綜合征是最常見的先天性疾病,大多數(shù)患者有輕至中度的智力障礙,迄今尚無有效的治療方法。減少唐氏綜合征危害的根本辦法是采取積極的一級和二級預防措施,避免患兒出生。
　　目前唐氏綜合征的常規(guī)診斷方法主要是在孕中期血清學篩查的基礎上,對高危孕婦通過羊膜腔穿刺或絨毛膜取樣獲取細胞體外培養(yǎng)后進行核型分析。這些方法周期長、創(chuàng)傷大,胎兒丟失率約為1％,10％左右的

2、高危孕婦為此拒絕接受這些侵入性檢查。所以,尋找并建立早期、快速、準確和無創(chuàng)性唐氏綜合征診斷方法,是亟待解決的關鍵臨床問題,也是產(chǎn)前診斷的重要目標之一。
　　無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷是指通過采取孕婦的外周血,獲得胎兒細胞或游離的胎兒核酸從而診斷胎兒的遺傳疾病。其中,孕婦外周血中游離的胎兒DNA含量相對豐富,是胎兒細胞的970倍,占孕婦總DNA的3.4％-6.2％,且比胎兒mRNA穩(wěn)定,采血24小時后含量幾乎無變化,更適用于無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷,但所

3、面臨的關鍵問題是如何在孕婦外周血中區(qū)分出游離的胎兒DNA和母體DNA。
　　研究顯示,孕婦外周血中母體DNA主要來源于造血細胞,而游離的胎兒DNA主要來源于胎盤滋養(yǎng)細胞。兩者的組織來源不同,造成某些DNA片段的甲基化水平存在相當大的差異,這種差異可以作為區(qū)分母胎DNA的生物學標志。有研究報道,位于染色體18q21.3上的SERPINB5基因啟動子在孕婦白細胞中呈現(xiàn)高度甲基化而在胎盤組織中卻很少甲基化,可認為非甲基化的SERPINB

4、5(U-SERPINB5)基因來源于胎兒。
　　為了尋找位于21號染色體上、在母胎之間存在甲基化差異的DNA片段,我們選取了21號染色體上6個基因——CGI137,LRRC3,POTE,COL6A1,AIRE和DSCR4。這些基因的mRNA都是胎盤特異性或高表達的,由此推測它們的啟動子區(qū)域在胎盤組織中是低甲基化,而在母親外周血白細胞中是高甲基化的。
　　通過聯(lián)合甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶酶切和甲基化結(jié)合結(jié)構(gòu)域法,我們比較所選取

5、的6個基因啟動子區(qū)域的DNA片段在早孕期和晚孕期的孕婦外周血白細胞DNA和胎盤組織DNA之間的甲基化差異,發(fā)現(xiàn)AIRE、POTE和DSCR4基因片段在早孕期的母胎之間有甲基化差異。
　　通過亞硫酸氫鹽處理后PCR克隆測序,我們檢測了所選基因片段內(nèi)每個CG位點的甲基化狀態(tài),發(fā)現(xiàn)DSCR4基因片段的12個CG位點在母胎之間的甲基化差異最為顯著——在早孕期胎盤組織中呈低甲基化狀態(tài),而在相應的孕婦外周血白細胞中則呈高度甲基化狀態(tài)。

6、　　為了排除克隆測序時的抽樣誤差,我們通過亞硫酸氫鹽聯(lián)合限制性內(nèi)切酶分析法,證實所有亞硫酸氫鹽處理后DSCR4PCR產(chǎn)物中兩個位于酶切位點內(nèi)的CG位點確實存在如上所述的母胎甲基化差異。
　　根據(jù)亞硫酸氫鹽測序的結(jié)果,我們設計了DSCR4甲基化特異性PCR的引物,通過甲基化特異性PCR,我們證實非甲基化的DSCR4(U-DSCR4)只存在于胎盤組織中,針對U-DSCR4的引物擴增效果好,無引物二聚體,可用熒光染料法(SYBRGree

7、nⅠ)進行定量檢測。相對定量分析顯示,U-DSCR4只存在于早孕期孕婦外周血血漿,而不存在于白細胞中,是位于21號染色體上的胎兒表觀遺傳學標志。
　　DSCR4(Down syndrome critical region gene 4)是唐氏綜合征關鍵區(qū)域內(nèi)的基因之一。DSCR4的mRNA只存在于胎盤組織和兩種人絨癌細胞系(JEG3、BeWo)中。唐氏綜合征胎兒由于染色體異常,所有的器官包括胎盤同樣可能受到影響,特別是對合體滋養(yǎng)層

8、的影響更大,導致胎盤產(chǎn)物生成異常,滋養(yǎng)層功能下降,多個唐氏血清學篩查標志(PAPP-A、hCG等)即基于此原理。胎盤特異性表達的DSCR4基因在唐氏胎盤滋養(yǎng)層異常的發(fā)生中的功能因而成為我們的研究對象。
　　甲基化特異性PCR證實DSCR4啟動子區(qū)域在JEG3和BeWo細胞中低甲基化,而在HEK293細胞中高甲基化,提示該基因的甲基化可能和基因表達有關。為了研究DSCR4基因功能,我們原核表達了DSCR4全長蛋白質(zhì),作為抗原免疫家兔

9、制備DSCR4的抗血清并通過蛋白A/G beads進行親和純化。免疫印跡(Western blot,WB)證實純化后的抗血清特異性顯著改善。通過構(gòu)建綠色熒光蛋白DSCR4融合蛋白瞬時轉(zhuǎn)染BeWo細胞,檢測外源性DSCR4的亞細胞定位以及用自制的抗體直接檢測BeWo細胞內(nèi)源性DSCR4的細胞分布,并通過分別抽提BeWo和JEG3細胞的細胞核和細胞漿蛋白,用抗體進行WB都證實DSCR4定位在滋養(yǎng)細胞核內(nèi)。隨后,我們合成3個針對DSCR4 m

10、RNA的小干擾片段(siRNA),RT-PCR和WB證實2號小干擾片段對DSCR4的轉(zhuǎn)錄和翻譯有明顯的干擾效果。下調(diào)DSCR4可以抑制細胞的遷移和侵襲,但不影響細胞增殖。
　　第二部分唐氏綜合征相關微小RNA——microRNA-125b相關功能的研究
　　微小RNA(microRNA,miRNA)是生物體內(nèi)長約17-25個核苷酸的非編碼小RNA。在細胞核內(nèi),編碼miRNA的基因最初轉(zhuǎn)錄生成pri-miRNA,經(jīng)過剪切生成6

11、0-100個堿基大小、具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的單鏈RNA前體(pre-miRNA),然后被轉(zhuǎn)入細胞質(zhì),在Dicer酶加工下形成miRNA成熟體,成熟體miRNA通過與靶mRNA間的互補配對,導致靶mRNA的降解或翻譯抑制,從而實現(xiàn)對靶基因的負調(diào)控。
　　唐氏綜合征患者伴發(fā)白血病的比例較高,所以研究唐氏綜合征相關miRNA在腫瘤中的作用也成為我們關注的對象,又因為乳腺癌是本實驗室的主要研究方向之一,我們選擇了乳腺癌為模型來研究唐氏綜合征相關m

12、iRNA在腫瘤中的作用。通過總RNA加尾后RT-PCR(poly A RT-PCR)分析了五個唐氏綜合征相關miRNA在乳腺癌細胞中的表達,我們發(fā)現(xiàn)mir-125b在高侵襲性乳腺癌細胞中高表達,這提示它可能參與乳腺癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。
　　在mir-125b高表達的乳腺癌細胞中,下調(diào)mir-125b可以抑制細胞的侵襲轉(zhuǎn)移和增殖能力:相反,在低表達mir-125b的乳腺癌細胞中,上調(diào)mir-125b會增強細胞的侵襲轉(zhuǎn)移和增殖能力。我

13、們通過裸鼠成瘤實驗進一步確認下調(diào)mir-125b可導致肺轉(zhuǎn)移灶數(shù)目的減少。在尋找mir-125b的靶基因過程中,我們通過多種方法證明mir-125b可作用于一系列的抑癌基因,它們包括BDP1、P53、BAP1、BAK1和ST18,這也進一步證明了mir-125b的癌基因活性,同時也發(fā)現(xiàn)mir-125b主要作用于BDP1的轉(zhuǎn)錄水平,對BAK1的轉(zhuǎn)錄水平稍有影響,而對P53、BAP1的轉(zhuǎn)錄水平影響不大。臨床樣本分析也顯示,與良性乳腺纖維腺瘤