Ⅲ型分泌系統(tǒng)轉(zhuǎn)位子蛋白EseC影響遲緩愛德華菌胞內(nèi)生存機(jī)制.pdf

1、遲緩愛德華菌（Edwardsiella tarda，簡稱E.tarda）感染宿主范圍很廣，是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的重要病原體。它能夠在巨噬細(xì)胞內(nèi)生存和繁殖，是其致病的關(guān)鍵。已有研究表明Ⅲ型分泌系統(tǒng)(T3SS)是E.tarda的一個重要毒力因子，EseB、EseC和EseD是T3SS重要的轉(zhuǎn)位子蛋白，其中EseC和EseD可插入宿主細(xì)胞膜，EseB則為游離部分。當(dāng)E.tarda與宿主細(xì)胞接觸后，EseB、EseC和EseD會迅速組成轉(zhuǎn)運復(fù)合物在宿主

2、細(xì)胞膜鉆孔，可以將E.tarda的效應(yīng)蛋白輸入宿主細(xì)胞，影響E.tarda的胞內(nèi)生存。EseC已被初步證明可影響E.tarda的胞內(nèi)生存，但其具體機(jī)制不完全清楚。
　　本文利用自殺質(zhì)粒pHM5構(gòu)建重組自殺質(zhì)粒，運用同源重組原理，缺失Et.CD株的eseC基因，得到eseC缺失株，并用PCR鑒定。再用pACYC184質(zhì)粒構(gòu)建eseC基因的重組質(zhì)粒，電擊導(dǎo)入缺失株中，得到缺失菌株的互補(bǔ)菌株并鑒定。
　　為了探索EseC是否影響E

3、.tarda細(xì)胞毒性和感染的細(xì)胞凋亡，以不同的MOI野生株，eseC缺失株和互補(bǔ)株分別感染巨噬細(xì)胞后，采用CCK-8試劑盒檢測巨噬細(xì)胞的存活率。結(jié)果提示，eseC基因缺失后，Et.CD株對細(xì)胞的毒性明顯降低。以MOI10∶1大腸桿菌BL21，野生株、eseC缺失株和互補(bǔ)株分別感染巨噬細(xì)胞，延長培養(yǎng)2h和6h，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡和焦亡情況。結(jié)果提示，eseC基因的缺失，影響了T3SS的表達(dá)，繼而影響了T3SS早期抑制巨噬細(xì)胞凋亡和誘導(dǎo)

4、巨噬細(xì)胞焦亡。
　　為了證明EseC影響Et.CD株在巨噬細(xì)胞胞內(nèi)的生存。采用平板計數(shù)法，比較野生株、eseC缺失株和互補(bǔ)株以100∶1的MOI分別感染巨噬細(xì)胞后，不同延長培養(yǎng)時間的胞內(nèi)細(xì)菌存活數(shù)目。結(jié)果表明，雖然野生株、eseC缺失株和互補(bǔ)株均可在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活并繁殖，但缺失株胞內(nèi)繁殖速率明顯低于野生株和互補(bǔ)株，野生株和互補(bǔ)株繁殖速率沒有差異，說明eseC基因?qū)τ诰S持Et.CD株在巨噬細(xì)胞內(nèi)的繁殖速率起重要的作用。
　　為

5、了進(jìn)一步探索EseC影響Et.CD株巨噬細(xì)胞胞內(nèi)生存的機(jī)制，采用流式檢測分別，比較野生株、eseC缺失株和互補(bǔ)株以10∶1的MOI細(xì)菌感染巨噬細(xì)胞后，延長培養(yǎng)時間2h和6h，巨噬細(xì)胞產(chǎn)生活性氧和活性氮的水平。延長培養(yǎng)2h的結(jié)果顯示，缺失株組明顯高于野生株組，互補(bǔ)株組接近野生株組;這表明eseC基因?qū)τ贓.tarda在巨噬細(xì)胞胞內(nèi)早期生存很重要，抑制巨噬細(xì)胞產(chǎn)生活性氧和活性氮。體外應(yīng)激實驗結(jié)果也表明，相比野生株，缺失株對過氧化氫的敏感性顯

6、著提高。采用流式細(xì)胞儀收集標(biāo)記過酸性探針的細(xì)胞，建立巨噬細(xì)胞內(nèi)pH和標(biāo)記酸性探針的細(xì)胞比率的標(biāo)準(zhǔn)曲線。野生株和缺失株分別感染巨噬細(xì)胞后，延長培養(yǎng)不同時間，流式細(xì)胞儀檢測酸性探針的細(xì)胞，從標(biāo)準(zhǔn)曲線得出胞內(nèi)pH。結(jié)果表明，野生株T3SS能夠干擾巨噬細(xì)胞酸性環(huán)境的形成，而缺失株不干擾。采用RT-PCR檢測E.tarda的T3SS效應(yīng)蛋白基因eseE和eseJ的表達(dá)水平，并以16SrRNA基因作為內(nèi)標(biāo)參照。結(jié)果表明，eseC缺失株的中EseJ和

7、EesE的轉(zhuǎn)錄水平比野生株明顯降低，互補(bǔ)株中這些基因的轉(zhuǎn)錄水平與野生株之間并未有明顯差別。這表明eseC基因的缺失影向了EesE和EseJ分泌到宿主細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮效應(yīng)。
　　為了探索EseC蛋白是否可以影響E.tarda小鼠體內(nèi)的生存，比較Et.CD野生株和eseC缺失株感染小鼠的半數(shù)致死量(LD50)。結(jié)果表明，野生株的毒力約為eseC缺失株的毒力4.05倍，說明eseC缺失株的毒力明顯降低。與Et.CD野生株在小鼠體內(nèi)存活能力對比

8、，缺失株在肝臟、脾臟、肺臟和腎臟中的細(xì)菌數(shù)目明顯降低。比較野生株和eseC缺失株感染小鼠不同天數(shù)后，肝臟、脾臟、肺臟和腎臟的外觀和重量。發(fā)現(xiàn)除腎臟外，野生株感染組織的外觀和重量均顯著大于eseC缺失株。感染細(xì)菌的小鼠組織在不同時間點用蘇木精—伊紅染色后，用光學(xué)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，eseC缺失株感染組的組織損傷和急性炎性反應(yīng)均明顯低于野生株感染組。用ELISA法檢測感染E.tarda的小鼠血清中IL-1β和TNF-α的濃度，感染1～11d后，

9、野生株組的IL-1β和TNF-α的濃度均明顯高于缺失株組，結(jié)果表明，eseC的缺失，影響了E tarda誘發(fā)細(xì)胞因子的產(chǎn)生。
　　綜上所述，E.tarda感染巨噬細(xì)胞后，EseC通過調(diào)節(jié)EseE和EseJ的產(chǎn)生，抑制巨噬細(xì)胞凋亡和細(xì)胞毒性，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞焦亡，抑制巨噬細(xì)胞產(chǎn)生活性氧和活性氮，干擾巨噬細(xì)胞的酸性環(huán)境，有利于細(xì)菌的毒力、細(xì)菌在巨噬細(xì)胞和小鼠體內(nèi)的生存、引起小鼠急性組織損傷和急性炎癥反應(yīng)。本研究為深入探討E.tarda菌T