Eha調(diào)控遲緩愛(ài)德華氏菌適應(yīng)胞內(nèi)生存環(huán)境的機(jī)制探索.pdf

1、遲緩愛(ài)德華菌（Edwardsiella tarda，Et）屬于腸桿菌科愛(ài)德華菌屬，是一種胞內(nèi)寄生菌。遲緩愛(ài)德華菌溶血相關(guān)基因(Ethaemolysin activator gene，簡(jiǎn)稱eha)是一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因，能夠調(diào)控Et抵抗巨噬細(xì)胞內(nèi)氧化和酸化等殺菌壓力，有助于Et在巨噬細(xì)胞內(nèi)的生存。然而，這機(jī)制尚未完全闡明。
　　為了檢測(cè)不同應(yīng)激環(huán)境下的eha基因轉(zhuǎn)錄水平。首先以Et菌ET-13基因組為模板，擴(kuò)增eha基因的啟動(dòng)子區(qū)

2、域，構(gòu)建eha基因的啟動(dòng)子探針pMP220-PehaLacZ載體，并將其電擊導(dǎo)入eha缺失株，獲得pMP220-PehaLacZ-△eha株。然后模擬細(xì)菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)的生存環(huán)境，檢測(cè)了在不同的氧化及酸性條件下含該載體細(xì)菌的β-gal活性，發(fā)現(xiàn)對(duì)數(shù)期細(xì)菌在條件pH6.3和0.10％H2O2LB處理2h轉(zhuǎn)錄水平較高，而前者轉(zhuǎn)錄水平最高。為了進(jìn)一步檢測(cè)eha基因是否存在對(duì)自身的調(diào)控，比較在pH6.3和0.10％H2O2處理2h對(duì)數(shù)期pMP22

3、0-PehaLacZ-ET13菌和pMP220-PehaLacZ-△eha菌的β-gal活性，發(fā)現(xiàn)含該載體的野生菌β-gal的活性均明顯低于該載體的缺失菌(p＜0.05)，說(shuō)明eha基因?qū)τ谧陨肀磉_(dá)起負(fù)調(diào)控作用。
　　選擇一個(gè)Eha轉(zhuǎn)錄水平最高的條件(pH6.3)，培養(yǎng)ET-13野生株與eha缺失株，分別提取兩細(xì)菌的RNA，其純度高，滿足建庫(kù)要求，送華大公司進(jìn)行Illumina HiSeqTM2000轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-Seque

4、ncing），該序列信息已提交至NCBI Sequence Read Achieve數(shù)據(jù)庫(kù)（登錄號(hào):SRX1898774），并進(jìn)行測(cè)序質(zhì)量評(píng)估。為了構(gòu)建Et菌的兩個(gè)cDNA文庫(kù)，其mRNA被隨機(jī)性打斷，其隨機(jī)性評(píng)估表明，這兩細(xì)菌測(cè)序不同的長(zhǎng)度的clean reads在Et菌ATCC15947參考基因組中分布均勻。利用比對(duì)軟件SOAPaligner/SOAP2軟件，將clean reads與Et菌ATCC15947參考基因組序列進(jìn)行比對(duì)，

5、這兩細(xì)菌的clean reads中覆蓋率在90％以上的基因分別超過(guò)92％。采用RNA-Sequencing測(cè)序比較了這兩細(xì)菌在酸性條件下的轉(zhuǎn)錄本，篩選出147個(gè)差異表達(dá)基因（|log2Ratio|≥1），其中113個(gè)基因表達(dá)水平上調(diào)，34個(gè)基因表達(dá)水平下調(diào)。此外，選取15個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行qRT-PCR隨機(jī)抽樣，兩者趨勢(shì)呈強(qiáng)相關(guān)，驗(yàn)證RNA-Sequencing數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。通過(guò)對(duì)147個(gè)基因采用CO數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行功能聚類，分成25類，主要

6、涉及細(xì)菌加工、定位、代謝、結(jié)合、催化、運(yùn)輸、細(xì)胞成份;通過(guò)對(duì)147個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG Pathway富集分析，有130個(gè)基因可以富集到55條路徑(Pathway)中，包括與氨基酸、核苷酸、脂質(zhì)代謝及鐵的轉(zhuǎn)運(yùn)等路徑，涉及基因較多的有雙組分系統(tǒng)、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)、不同環(huán)境中的微生物代謝和次級(jí)代謝產(chǎn)物等路徑。
　　為了進(jìn)一步尋找Eha直接調(diào)控靶點(diǎn)，利用商品化的Flag單抗富集Eha-Flag蛋白，首先eha基因的3末端引入了PCR

7、的Flag標(biāo)簽.構(gòu)建Eha蛋白融合表達(dá)載體pGEX-4T-ehaflag，然后將該載體電擊入eha缺失株中，細(xì)菌感染細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，Eha-Flag融合蛋白可以恢復(fù)eha缺失株在胞內(nèi)降低生存的能力。進(jìn)一步摸索染色質(zhì)免疫共沉淀超聲的條件，利用商品化的Flag單抗免疫沉淀Eha-DNA片段，除去結(jié)合的蛋白并純化DNA片段。并根據(jù)RNA-sequencing得到的差異表達(dá)基因設(shè)計(jì)引物，通過(guò)熒光定量PCR鑒定ChIP富集到Eha的結(jié)合靶點(diǎn)，