遲緩愛德華氏菌EsaB-EsaL-EsaM調(diào)控Ⅲ型分泌系統(tǒng)輸送器蛋白和效應分子的分泌.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、遲緩愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)是一類感染宿主范圍廣泛的革蘭氏陰性致病菌,引起魚類的愛德華氏菌病,對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成嚴重經(jīng)濟損失。Ⅲ型分泌系統(tǒng)(TypeⅢsecretion system,T3SS)是細菌重要的毒力因子分泌系統(tǒng),細菌通過Ⅲ型分泌系統(tǒng)將毒力蛋白直接輸入宿主細胞,干擾正常的細胞活動,促進細菌在細胞內(nèi)復制和繁殖。本研究以遲緩愛德華氏菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)調(diào)控蛋白EsaB/EsaL/EsaM為研究對象,圍繞EsaL如

2、何控制Ⅲ型分泌系統(tǒng)底物分泌展開研究,為闡明遲緩愛德華氏菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)的分子致病機理及研制弱毒疫苗奠定基礎。
  研究發(fā)現(xiàn)EsaL不是Ⅲ型分泌系統(tǒng)的分泌蛋白,其主要分布于細菌膜相。esaL缺失后,輸送器蛋白EseB/EseC/EseD分泌顯著減少,說明EsaL促進輸送器蛋白分泌。改變環(huán)境條件,如Ca2+濃度和pH,不影響EsaL對輸送器蛋白分泌的促進作用。然而,EsaL對效應分子分泌的控制作用隨環(huán)境因子改變而變化:當Ca2+濃度增高

3、或降低時,EsaL不影響效應分子的分泌;當pH為酸性條件時,EsaL促進效應分子分泌,中性條件下則不影響效應分子的分泌。
  報道顯示,EsaL同源蛋白,如Salmonella SsaL、EPEC/EHEC SepL和Yersinia YopN,均與各自的Ⅲ型分泌系統(tǒng)的另外兩個蛋白形成復合物(即SpiC/SsaL/SsaM、SepD/SepL/CesL和YscB/YopN/SycN),從而控制Ⅲ型分泌系統(tǒng)的蛋白分泌,細菌缺失這些相

4、互作用的蛋白通常具有相似的胞外分泌表型。通過序列分析,發(fā)現(xiàn)EsaB和EsaM可能是遲緩愛德華氏菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)中EsaL的互作蛋白,且△esaB和△esaM的輸送器蛋白分泌亦明顯減少,表明EsaB和EsaM也可促進輸送器蛋白分泌。利用酵母雙雜交和免疫共沉淀技術(shù),進一步確定了EsaL、EsaB和EsaM三者的相互作用關(guān)系:EsaL能單獨與EsaB或EsaM互作,esaB或esaM缺失不影響EsaL與另一個蛋白相互作用;EsaB和EsaM之間

5、也存在相互作用,而這種互作不依賴EsaL。與EsaL一樣,EsaB和EsaM也是胞內(nèi)蛋白。由于esaB或esaM缺失后,胞內(nèi)EsaM或EsaB總量降低,表明兩者可能互相穩(wěn)定。蛋白穩(wěn)定性實驗證實了這一推測:esaB或esaM缺失,胞內(nèi)EsaM和EsaB的總量隨時間變化減少,EsaM對EsaB的穩(wěn)定作用尤為顯著,但胞內(nèi)EsaL含量不隨時間變化而減少,提示EsaB和EsaM不具有穩(wěn)定EsaL的作用。當細菌在酸性pH生長時,EsaL、EsaB和

6、EsaM均能促進效應分子分泌;pH由酸性向中性變化時,△esaL胞外EseG分泌量增加,而△esaB和△esaM胞外EseG分泌持續(xù)受到抑制,說明EsaL在酸性條件下促進效應分子分泌,而中性時抑制效應分子分泌;EsaB和EsaM在酸性及中性條件下均促進效應分子的分泌。此外,在中性pH條件下培養(yǎng)遲緩愛德華氏菌,再更換培養(yǎng)基使其pH為酸性或中性時,EsaL能感受pH變化,促進效應分子分泌,EsaL控制效應分子分泌隨培養(yǎng)條件變化而不同。

7、>  CyaA轉(zhuǎn)導實驗表明esaL缺失不影響效應分子進入宿主細胞的效率;測定野生型(WT)和△esaL感染細胞后培養(yǎng)上清乳酸脫氫酶水平,發(fā)現(xiàn)兩者無明顯差異,說明esaL不參與Etarda引起的細胞毒性。而esaB和esaM缺失后效應分子進入宿主細胞的量顯著低于WT。對于魚類感染實驗,esaL缺失后遲緩愛德華氏菌半數(shù)致死劑量LD50(median lethal dose)上升3.39倍,7d后藍曼龍的存活率為97.22%;△esaB和△e

8、saM感染后存活率為97.22%和100%,而此時WT感染組藍曼龍存活率只有30.55%。競爭感染實驗表明△esaL、△esaB和△esaM的競爭感染指數(shù)分別為0.17±0.05、0.12±0.03和0.05±0.03,三者均極顯著小于1(P<0.001),表明esaL、esaB和esaM缺失后,細菌毒力顯著降低。這些體內(nèi)實驗表明esaL、esaB和esaM能通過控制輸送器蛋白以及效應分子的分泌及轉(zhuǎn)運,在遲緩愛德華氏菌的致病過程中發(fā)揮作

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