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1、遲緩愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)是一類感染宿主范圍廣泛的革蘭氏陰性致病菌,引起魚類的愛德華氏菌病,對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。Ⅲ型分泌系統(tǒng)(TypeⅢsecretion system,T3SS)是細(xì)菌重要的毒力因子分泌系統(tǒng),細(xì)菌通過(guò)Ⅲ型分泌系統(tǒng)將毒力蛋白直接輸入宿主細(xì)胞,干擾正常的細(xì)胞活動(dòng),促進(jìn)細(xì)菌在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和繁殖。本研究以遲緩愛德華氏菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)調(diào)控蛋白EsaB/EsaL/EsaM為研究對(duì)象,圍繞EsaL如
2、何控制Ⅲ型分泌系統(tǒng)底物分泌展開研究,為闡明遲緩愛德華氏菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)的分子致病機(jī)理及研制弱毒疫苗奠定基礎(chǔ)。
研究發(fā)現(xiàn)EsaL不是Ⅲ型分泌系統(tǒng)的分泌蛋白,其主要分布于細(xì)菌膜相。esaL缺失后,輸送器蛋白EseB/EseC/EseD分泌顯著減少,說(shuō)明EsaL促進(jìn)輸送器蛋白分泌。改變環(huán)境條件,如Ca2+濃度和pH,不影響EsaL對(duì)輸送器蛋白分泌的促進(jìn)作用。然而,EsaL對(duì)效應(yīng)分子分泌的控制作用隨環(huán)境因子改變而變化:當(dāng)Ca2+濃度增高
3、或降低時(shí),EsaL不影響效應(yīng)分子的分泌;當(dāng)pH為酸性條件時(shí),EsaL促進(jìn)效應(yīng)分子分泌,中性條件下則不影響效應(yīng)分子的分泌。
報(bào)道顯示,EsaL同源蛋白,如Salmonella SsaL、EPEC/EHEC SepL和Yersinia YopN,均與各自的Ⅲ型分泌系統(tǒng)的另外兩個(gè)蛋白形成復(fù)合物(即SpiC/SsaL/SsaM、SepD/SepL/CesL和YscB/YopN/SycN),從而控制Ⅲ型分泌系統(tǒng)的蛋白分泌,細(xì)菌缺失這些相
4、互作用的蛋白通常具有相似的胞外分泌表型。通過(guò)序列分析,發(fā)現(xiàn)EsaB和EsaM可能是遲緩愛德華氏菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)中EsaL的互作蛋白,且△esaB和△esaM的輸送器蛋白分泌亦明顯減少,表明EsaB和EsaM也可促進(jìn)輸送器蛋白分泌。利用酵母雙雜交和免疫共沉淀技術(shù),進(jìn)一步確定了EsaL、EsaB和EsaM三者的相互作用關(guān)系:EsaL能單獨(dú)與EsaB或EsaM互作,esaB或esaM缺失不影響EsaL與另一個(gè)蛋白相互作用;EsaB和EsaM之間
5、也存在相互作用,而這種互作不依賴EsaL。與EsaL一樣,EsaB和EsaM也是胞內(nèi)蛋白。由于esaB或esaM缺失后,胞內(nèi)EsaM或EsaB總量降低,表明兩者可能互相穩(wěn)定。蛋白穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)證實(shí)了這一推測(cè):esaB或esaM缺失,胞內(nèi)EsaM和EsaB的總量隨時(shí)間變化減少,EsaM對(duì)EsaB的穩(wěn)定作用尤為顯著,但胞內(nèi)EsaL含量不隨時(shí)間變化而減少,提示EsaB和EsaM不具有穩(wěn)定EsaL的作用。當(dāng)細(xì)菌在酸性pH生長(zhǎng)時(shí),EsaL、EsaB和
6、EsaM均能促進(jìn)效應(yīng)分子分泌;pH由酸性向中性變化時(shí),△esaL胞外EseG分泌量增加,而△esaB和△esaM胞外EseG分泌持續(xù)受到抑制,說(shuō)明EsaL在酸性條件下促進(jìn)效應(yīng)分子分泌,而中性時(shí)抑制效應(yīng)分子分泌;EsaB和EsaM在酸性及中性條件下均促進(jìn)效應(yīng)分子的分泌。此外,在中性pH條件下培養(yǎng)遲緩愛德華氏菌,再更換培養(yǎng)基使其pH為酸性或中性時(shí),EsaL能感受pH變化,促進(jìn)效應(yīng)分子分泌,EsaL控制效應(yīng)分子分泌隨培養(yǎng)條件變化而不同。
7、> CyaA轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)表明esaL缺失不影響效應(yīng)分子進(jìn)入宿主細(xì)胞的效率;測(cè)定野生型(WT)和△esaL感染細(xì)胞后培養(yǎng)上清乳酸脫氫酶水平,發(fā)現(xiàn)兩者無(wú)明顯差異,說(shuō)明esaL不參與Etarda引起的細(xì)胞毒性。而esaB和esaM缺失后效應(yīng)分子進(jìn)入宿主細(xì)胞的量顯著低于WT。對(duì)于魚類感染實(shí)驗(yàn),esaL缺失后遲緩愛德華氏菌半數(shù)致死劑量LD50(median lethal dose)上升3.39倍,7d后藍(lán)曼龍的存活率為97.22%;△esaB和△e
8、saM感染后存活率為97.22%和100%,而此時(shí)WT感染組藍(lán)曼龍存活率只有30.55%。競(jìng)爭(zhēng)感染實(shí)驗(yàn)表明△esaL、△esaB和△esaM的競(jìng)爭(zhēng)感染指數(shù)分別為0.17±0.05、0.12±0.03和0.05±0.03,三者均極顯著小于1(P<0.001),表明esaL、esaB和esaM缺失后,細(xì)菌毒力顯著降低。這些體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明esaL、esaB和esaM能通過(guò)控制輸送器蛋白以及效應(yīng)分子的分泌及轉(zhuǎn)運(yùn),在遲緩愛德華氏菌的致病過(guò)程中發(fā)揮作
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