遲緩愛德華氏菌EsaB-EsaL-EsaM調(diào)控Ⅲ型分泌系統(tǒng)輸送器蛋白和效應(yīng)分子的分泌.pdf

1、遲緩愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)是一類感染宿主范圍廣泛的革蘭氏陰性致病菌，引起魚類的愛德華氏菌病，對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。Ⅲ型分泌系統(tǒng)(TypeⅢsecretion system，T3SS)是細(xì)菌重要的毒力因子分泌系統(tǒng)，細(xì)菌通過Ⅲ型分泌系統(tǒng)將毒力蛋白直接輸入宿主細(xì)胞，干擾正常的細(xì)胞活動，促進(jìn)細(xì)菌在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和繁殖。本研究以遲緩愛德華氏菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)調(diào)控蛋白EsaB/EsaL/EsaM為研究對象，圍繞EsaL如

2、何控制Ⅲ型分泌系統(tǒng)底物分泌展開研究，為闡明遲緩愛德華氏菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)的分子致病機(jī)理及研制弱毒疫苗奠定基礎(chǔ)。
　　研究發(fā)現(xiàn)EsaL不是Ⅲ型分泌系統(tǒng)的分泌蛋白，其主要分布于細(xì)菌膜相。esaL缺失后，輸送器蛋白EseB/EseC/EseD分泌顯著減少，說明EsaL促進(jìn)輸送器蛋白分泌。改變環(huán)境條件，如Ca2+濃度和pH，不影響EsaL對輸送器蛋白分泌的促進(jìn)作用。然而，EsaL對效應(yīng)分子分泌的控制作用隨環(huán)境因子改變而變化:當(dāng)Ca2+濃度增高

3、或降低時，EsaL不影響效應(yīng)分子的分泌;當(dāng)pH為酸性條件時，EsaL促進(jìn)效應(yīng)分子分泌，中性條件下則不影響效應(yīng)分子的分泌。
　　報道顯示，EsaL同源蛋白，如Salmonella SsaL、EPEC/EHEC SepL和Yersinia YopN，均與各自的Ⅲ型分泌系統(tǒng)的另外兩個蛋白形成復(fù)合物（即SpiC/SsaL/SsaM、SepD/SepL/CesL和YscB/YopN/SycN），從而控制Ⅲ型分泌系統(tǒng)的蛋白分泌，細(xì)菌缺失這些相

4、互作用的蛋白通常具有相似的胞外分泌表型。通過序列分析，發(fā)現(xiàn)EsaB和EsaM可能是遲緩愛德華氏菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)中EsaL的互作蛋白，且△esaB和△esaM的輸送器蛋白分泌亦明顯減少，表明EsaB和EsaM也可促進(jìn)輸送器蛋白分泌。利用酵母雙雜交和免疫共沉淀技術(shù)，進(jìn)一步確定了EsaL、EsaB和EsaM三者的相互作用關(guān)系:EsaL能單獨與EsaB或EsaM互作，esaB或esaM缺失不影響EsaL與另一個蛋白相互作用;EsaB和EsaM之間

5、也存在相互作用，而這種互作不依賴EsaL。與EsaL一樣，EsaB和EsaM也是胞內(nèi)蛋白。由于esaB或esaM缺失后，胞內(nèi)EsaM或EsaB總量降低，表明兩者可能互相穩(wěn)定。蛋白穩(wěn)定性實驗證實了這一推測:esaB或esaM缺失，胞內(nèi)EsaM和EsaB的總量隨時間變化減少，EsaM對EsaB的穩(wěn)定作用尤為顯著，但胞內(nèi)EsaL含量不隨時間變化而減少，提示EsaB和EsaM不具有穩(wěn)定EsaL的作用。當(dāng)細(xì)菌在酸性pH生長時，EsaL、EsaB和

6、EsaM均能促進(jìn)效應(yīng)分子分泌;pH由酸性向中性變化時，△esaL胞外EseG分泌量增加，而△esaB和△esaM胞外EseG分泌持續(xù)受到抑制，說明EsaL在酸性條件下促進(jìn)效應(yīng)分子分泌，而中性時抑制效應(yīng)分子分泌;EsaB和EsaM在酸性及中性條件下均促進(jìn)效應(yīng)分子的分泌。此外，在中性pH條件下培養(yǎng)遲緩愛德華氏菌，再更換培養(yǎng)基使其pH為酸性或中性時，EsaL能感受pH變化，促進(jìn)效應(yīng)分子分泌，EsaL控制效應(yīng)分子分泌隨培養(yǎng)條件變化而不同。

7、>　　CyaA轉(zhuǎn)導(dǎo)實驗表明esaL缺失不影響效應(yīng)分子進(jìn)入宿主細(xì)胞的效率;測定野生型(WT)和△esaL感染細(xì)胞后培養(yǎng)上清乳酸脫氫酶水平，發(fā)現(xiàn)兩者無明顯差異，說明esaL不參與Etarda引起的細(xì)胞毒性。而esaB和esaM缺失后效應(yīng)分子進(jìn)入宿主細(xì)胞的量顯著低于WT。對于魚類感染實驗，esaL缺失后遲緩愛德華氏菌半數(shù)致死劑量LD50(median lethal dose)上升3.39倍，7d后藍(lán)曼龍的存活率為97.22％;△esaB和△e

8、saM感染后存活率為97.22％和100％，而此時WT感染組藍(lán)曼龍存活率只有30.55％。競爭感染實驗表明△esaL、△esaB和△esaM的競爭感染指數(shù)分別為0.17±0.05、0.12±0.03和0.05±0.03，三者均極顯著小于1(P＜0.001)，表明esaL、esaB和esaM缺失后，細(xì)菌毒力顯著降低。這些體內(nèi)實驗表明esaL、esaB和esaM能通過控制輸送器蛋白以及效應(yīng)分子的分泌及轉(zhuǎn)運，在遲緩愛德華氏菌的致病過程中發(fā)揮作