遲緩愛(ài)德華菌eha基因?qū)υ摼嚓P(guān)毒力的調(diào)控作用.pdf

1、目的：本實(shí)驗(yàn)主要探討遲緩愛(ài)德華菌（Edwardsiella tarda，簡(jiǎn)稱E.tarda）eha（Edwardsiella tarda haemolysin activator gene，簡(jiǎn)稱eha）基因，調(diào)控E.tarda相關(guān)毒力的作用。
　　 方法：利用自殺質(zhì)粒 pHM5構(gòu)建重組自殺質(zhì)粒，運(yùn)用同源重組原理，缺失E.tarda的eha基因，并用PCR證實(shí)。再用中等拷貝的質(zhì)粒pACYC184構(gòu)建含eha基因的重組質(zhì)粒pACYC

2、EHA，電擊導(dǎo)入缺失株△eha中，得到缺失株的互補(bǔ)株。測(cè)定野生株、突變株及互補(bǔ)株在限制性培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線。通過(guò)平板溶血性法、接觸溶血法、上清溶血法檢測(cè)，觀察野生株、缺失株及互補(bǔ)株溶血性的差異。通過(guò)E.tarda對(duì)過(guò)氧化氫的抵抗力實(shí)驗(yàn)，比較eha的缺失是否影響E.tarda對(duì)過(guò)氧化氫的抵抗力。利用MTT法比較野生株、缺失株及互補(bǔ)株細(xì)菌濾液對(duì)Vero細(xì)胞的毒性有無(wú)差別。利用RT-PCR觀察eha基因是否調(diào)控E.tarda鞭毛基因Flic的

3、轉(zhuǎn)錄。最后用超速酸化離心法提取E.tarda野生株和缺失株的鞭毛，再用SDS-PAGE電泳，比較eha基因是否對(duì)鞭毛蛋白的表達(dá)有調(diào)控作用。
　　 結(jié)果：成功構(gòu)建E.tarda的eha基因缺失株及缺失株的互補(bǔ)株。野生株、缺失株和互補(bǔ)株在限制培養(yǎng)基中均能正常生長(zhǎng)。平板溶血法和接觸溶血法結(jié)果顯示，缺失株和互補(bǔ)株不溶血，而野生株溶血。H2O2抗性結(jié)果顯示，在50mM、100mM和200mMH2O2作用濃度下，野生株與互補(bǔ)株的抑菌直徑相比

4、于缺失株的抑菌直徑顯著減少，其結(jié)果均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。Vero細(xì)胞毒性檢測(cè)結(jié)果顯示，野生株在50ul、1OOul濾液量時(shí)的細(xì)胞存活率明顯低于缺失株（P<0.05），也明顯低于互補(bǔ)株（P<0.05）。RT-PCR結(jié)果顯示，相比于E.tarda野生株，缺失株鞭毛基因Flic的轉(zhuǎn)錄水平顯著降低，而互補(bǔ)株鞭毛基因Flic的轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有明顯變化。通過(guò)用超速酸化離心法的提取的鞭毛蛋白的SOS-PAGE結(jié)果顯示，缺失株的鞭毛蛋白的表達(dá)水平