gp78在肝細胞脂肪變性中的作用及機制研究.pdf

1、研究背景：
　　脂肪肝(fatty liver disease，F(xiàn)LD)，是最常見的引起慢性肝病的疾病，威脅著全世界尤其是發(fā)展中國家人類的健康。肝病指南明確指出，F(xiàn)LD與代謝相關危險因素有密切的關系，尤其是肥胖、2型糖尿病和血脂代謝障礙。FLD分為酒精性脂肪肝(alcoholic fatty liver disease，AFLD)和非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)以及

2、兩者同時存在。NAFLD包括單純性脂肪性肝病和非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH）。NASH的發(fā)病機制與代謝紊亂和內質網(wǎng)（endoplasmic reticulum,ER）穩(wěn)態(tài)相關。gp78也稱為自分泌因子受體（autocrine motility factor receptor，AMFR），是一種E3泛素連接酶，在保護細胞免受內質網(wǎng)應激損傷中起到重要的作用。已有研究證實，gp78在調

3、節(jié)小鼠脂肪和能量代謝中發(fā)揮著重要的作用。然而目前關于gp78在肝細胞脂肪代謝中的具體作用還不清楚。本研究中我們將進一步發(fā)現(xiàn)gp78在肝細胞脂肪代謝中的作用以及探討相關的機制。研究目的：
　　1.在細胞水平建立肝細胞脂肪變性模型，明確gp78在肝細胞發(fā)生脂肪變性過程中表達水平的變化；
　　2.在發(fā)生脂肪變性的肝細胞中過表達或沉默gp78后，觀察肝細胞脂肪變性的程度；
　　3.明確過表達或沉默 gp78對脂肪分化/代謝相關

4、蛋白表達的影響；
　　4.研究gp78在肝細胞脂肪變性中的作用機制。
　　研究方法：
　　1.用一定濃度的油酸刺激小鼠肝細胞（AML12），應用油紅O染色的方法對細胞內的脂滴進行染色，應用相差顯微鏡對細胞內脂滴進行觀察拍照，應用甘油三酯測定方法對細胞內甘油三酯含量進行檢測，從而確定肝細胞脂肪變性的程度；
　　2.構建真核表達質粒PCMV5-HA-gp78，設計并驗證gp78的有效 siRNA干擾序列。應用脂質體轉

5、染的方法向細胞中轉染質?；騌NA；
　　3.提取細胞蛋白和RNA，分別應用western blot和Real time PCR對目的基因的表達水平進行檢測；
　　4.應用免疫熒光法明確gp78與Cidec在亞細胞的定位，以及應用免疫共沉淀技術確定gp78在肝細胞脂肪變性過程中與Cidec是否存在直接的直接相互作用關系。
　　研究結果：
　　1.應用一定濃度的油酸刺激小鼠肝細胞（AML12），在刺激后的0h，12h

6、，24h收集細胞，應用油紅O染色以及相差顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，隨著刺激時間延長，細胞內脂滴數(shù)目明顯增多，脂滴明顯增大，說明肝細胞脂肪變性模型建立成功。并同時在對應的時間點，提取細胞蛋白質和RNA，檢測細胞內gp78的表達水平，發(fā)現(xiàn)隨著刺激時間延長，gp78的表達含量也逐漸升高。
　　2.應用脂質體轉染過表達gp78和瞬轉gp78-siRNA沉默gp78，發(fā)現(xiàn)與未處理對照組相比，過表達gp78組肝細胞內脂滴數(shù)目增多，體積增大；而沉默gp7

7、8組脂滴數(shù)目減少，體積減小。
　　3.在研究過程中，Wenstern Blot結果顯示過表達或沉默gp78后，脂滴表面蛋白Cidec和PPARγ表達水平的變化與gp78一致。而共同過表達gp78和Cidec后，細胞內脂滴數(shù)目顯著增多，體積顯著增大。
　　4.免疫熒光結果顯示，gp78和Cidec在脂滴表面存在共同的亞細胞定位；免疫共沉淀結果顯示gp78和Cidec存在直接相互作用關系。
　　結論：
　　本研究證實