UHRF1對腎癌細(xì)胞增殖和侵襲的影響及機(jī)制研究.pdf

1、背景：
　　腎癌在成人惡性腫瘤中占2％，是泌尿系腫瘤患者的第三大死亡原因。盡管目前的診斷技術(shù)已經(jīng)比較先進(jìn)，但是仍有30%左右的腎癌患者在確診時已發(fā)生轉(zhuǎn)移。晚期腎癌患者對放化療的敏感性差，治療效果不理想，免疫治療（如IL-2和IFN-α）也只對10%～20%的患者有效。因此，迫切需要尋找新的有效的治療靶點和治療策略。
　　UHRF1(Ubiquitin-like protein containing PHD and RING

2、finger domains1)是多功能核蛋白 UHRF家族的成員之一，具有多個結(jié)構(gòu)域，包括一個泛素樣結(jié)構(gòu)域、一個植物同源結(jié)構(gòu)域（plant homeodomain，PHD）、一個SET和RING相關(guān)（SET and RING associated, SRA）結(jié)構(gòu)域和一個環(huán)指（RING finger）結(jié)構(gòu)域。UHRF1在多種腫瘤中呈高表達(dá)，并可通過特定結(jié)構(gòu)域參與DNA甲基化修飾和組蛋白翻譯后修飾，從而調(diào)控基因表達(dá)，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。研

3、究發(fā)現(xiàn)，UHRF1在腎癌組織中也呈高表達(dá)，且其表達(dá)水平與腎癌的病理分期和組織學(xué)分級密切相關(guān)。但是UHRF1在腎癌發(fā)生發(fā)展中的具體機(jī)制尚不清楚。因此我們擬探討UHRF1在腎癌發(fā)生發(fā)展中的作用及相關(guān)的分子機(jī)制，以期為尋找新的腎癌診斷指標(biāo)和治療靶點提供理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。
　　目的：
　　1．明確UHRF1在腎癌細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲過程中的作用；
　　2．明確UHRF1調(diào)節(jié)腎癌細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲的分子機(jī)制；
　　方法

4、：
　　1．設(shè)計并合成針對UHRF1的siRNA，轉(zhuǎn)染腎癌769-P和786-O細(xì)胞后利用Western blot和RT-PCR分別在蛋白水平和mRNA水平檢測UHRF1的表達(dá)情況，驗證siRNA的干擾效果。
　　2．用干擾效果良好的siRNA轉(zhuǎn)染769-P和786-O細(xì)胞后，用MTT檢測細(xì)胞增殖，并繪制細(xì)胞生長曲線，用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡，利用Transwell實驗檢測細(xì)胞的侵襲能力，檢測UHRF1的表達(dá)下調(diào)對細(xì)胞增殖、

5、凋亡和侵襲的影響。
　　3．用已經(jīng)證實干擾效果良好的表達(dá)shUHRF1的慢病毒和對照病毒感染769-P和786-O細(xì)胞后，接種于裸鼠皮下，每3天測量一次腫瘤長短徑，計算腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線。
　　4．利用數(shù)字基因表達(dá)譜技術(shù)，比較shUHRF1表達(dá)下調(diào)的769-P細(xì)胞和對照細(xì)胞中的差異表達(dá)基因，得到可能受UHRF1調(diào)控的下游靶基因，通過RT-PCR對這些差異表達(dá)基因進(jìn)行驗證，發(fā)現(xiàn)在UHRF1表達(dá)下調(diào)的細(xì)胞中腫瘤抑制基因T

6、XNIP的表達(dá)顯著上調(diào)。
　　5．用干擾效果良好的siRNA同時下調(diào)TXNIP和UHRF1，比較與單獨下調(diào)UHRF1的細(xì)胞在細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲能力的差異。
　　6．針對TXNIP基因的啟動子區(qū)設(shè)計引物，利用抗UHRF1的抗體及對照抗體進(jìn)行染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）實驗，檢測UHRF1是否直接結(jié)合于TXNIP基因的啟動子區(qū)，從而調(diào)控其表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1．在腎癌細(xì)胞769-P和786-O中下調(diào)UHRF1的

7、表達(dá)后，細(xì)胞凋亡明顯增加，細(xì)胞增殖及細(xì)胞侵襲能力明顯減弱。
　　2．UHRF1表達(dá)下調(diào)的769-P和786-O細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的生長受到顯著抑制。
　　3．在腎癌細(xì)胞中下調(diào)UHRF1的表達(dá)后，腫瘤抑制基因TXNIP的表達(dá)水平明顯上調(diào)。
　　4．同時下調(diào)TXNIP和UHRF1的表達(dá)，可有效挽救單獨下調(diào)UHRF1所引起的增殖和侵襲抑制及凋亡，說明TXNIP是UHRF1的有效下游靶基因。
　　5．ChIP結(jié)果顯示UHRF