慢病毒RNA干擾GPR78對(duì)腎癌細(xì)胞增殖和侵襲力的影響.pdf

1、腎細(xì)胞癌（RCC）又簡(jiǎn)稱腎癌，起源于腎實(shí)質(zhì)腎小管上皮細(xì)胞，是泌尿生殖系統(tǒng)中最為常見(jiàn)惡性腫瘤之一，在腎癌中最常見(jiàn)病理類型為腎透明細(xì)胞癌（CRCC）。CRCC治療以根治性切除術(shù)（RN）為主，由于早期臨床癥狀不明顯，臨床上以晚期患者為多。并且部分腎癌患者存在術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移以及多耐藥性，對(duì)放、化療治療不敏感，療效不佳。免疫治療由于長(zhǎng)期療效尚不能確定和總緩解率不高限制其廣泛推廣。因此深入研究腎細(xì)胞癌的增殖和侵襲的分子機(jī)制對(duì)提高早期診斷率和后續(xù)

2、治療療效十分關(guān)鍵。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)是GRP家族中的重要成員，與熱休克蛋白(HSP70)具有較高的同源性,屬于 HSP70家族成員之一。GRP78在腫瘤細(xì)胞株和腫瘤組織如肝癌、結(jié)腸癌及肺癌、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤等高表達(dá)，并可能與腫瘤的凋亡、耐藥密切相關(guān)。但GRP78在腎細(xì)胞癌中的癌細(xì)胞增殖和侵襲等方面所起的作用尚未清楚。本研究分為兩個(gè)部分：
　　第一部分：慢病毒RNA干擾GRP78基因載體的構(gòu)建及篩選。
　　目的：探

3、討慢病毒RNA干擾GPR78基因載體的構(gòu)建及篩選。
　　方法：構(gòu)建慢病毒靶向siRNA-GPR78干擾載體并轉(zhuǎn)染進(jìn)入腎癌786-0細(xì)胞株。轉(zhuǎn)染48h后利用Realtime-PCR和Western blot分別檢測(cè)GRP78mRNA和蛋白表達(dá)。篩選出一條抑制率最高的siRNA-GPR78進(jìn)入下一步研究。
　　結(jié)果：Realtime-PCR結(jié)果顯示與空白對(duì)照組(1.85±0.08)和陰性對(duì)照組(1.79±0.15)比較，GRP7

4、8mRNA的表達(dá)水平在siRNA1(0.32±0.09)、siRNA2(0.83±0.07)以及siRNA3組(0.79±0.11)均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；Western blot結(jié)果顯示與空白對(duì)照組(1±0.03)或陰性對(duì)照組(1±0.07)比較，GRP78蛋白表達(dá)水平在siRNA1組(0.21±0.03)、siRNA2組(0.79±0.03)以及siRNA3組(0.86±0.04)均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.

5、01)；空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組的GRP78mRNA和蛋白的表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。siRNA1抑制GRP78蛋白效率最佳。
　　結(jié)論：構(gòu)建成功的siRNA-GRP78慢病毒載體可有效抑制腎癌786-0細(xì)胞中的GRP78基因及蛋白表達(dá)，以siRNA1抑制GRP78蛋白效率最佳，選擇siRNA1進(jìn)下一步研究。
　　第二部分：RNA干擾GRP78基因?qū)δI癌細(xì)胞增殖和侵襲力的影響。
　　目的：探討RNA干擾G

6、PR78基因后對(duì)腎癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力的影響。
　　方法：將siRNA1-GRP78干擾載體轉(zhuǎn)染進(jìn)入腎癌786-0細(xì)胞中。利用MTT法和Transwell法分別檢測(cè)出腎癌細(xì)胞的增殖和侵襲力。
　　結(jié)果：MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，siRNA1組腎癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。Transwell法檢測(cè)結(jié)果顯示與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，siRNA1組腎癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制明顯，差異有