siRNA干擾BMPR-Ⅱ?qū)Ω伟┘毎鲋澈颓忠u的影響及VEGF-C信號通路機制的研究.pdf

1、背景:
　　骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bone Morphogenetic Proteins,BMPs)屬于轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β)家族成員,是一組能廣泛參與調(diào)節(jié)多種細胞的增殖、分化和凋亡的功能蛋白,在腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移中起重要作用。
　　骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)在肝癌的發(fā)生、發(fā)展中扮演著重要的角色。此前,課題組已對BMPs眾多亞型在肝癌細胞中的表達及功能和相關(guān)機制做了一系列的研究:發(fā)現(xiàn)BMP-2、3、4、5、6、7及BMPR

2、-II在肝癌中均有不成程度表達,并發(fā)現(xiàn)BMP-2、6,尤其是BMP-2呈高表達,并且能夠顯著促進肝癌細胞的侵襲。BMPs發(fā)揮其作用需通過其受體實現(xiàn),但其受體(BMPR)在肝癌中的作用及其介導肝癌侵襲增殖的具體的機制尚不清楚。最近研究表明骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體II(BMPR-II)是BMPs信號傳導途徑的關(guān)鍵調(diào)控因子,據(jù)此我們推測BMPR-II對肝癌細胞增殖和侵襲可能有重要的作用。
　　腫瘤微環(huán)境在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中占有重要的地位,腫

3、瘤微血管生成與腫瘤的侵襲增殖密切相關(guān),血管生成因子是調(diào)控和促進腫瘤血管生成的關(guān)鍵因素。VEGF-C作為主要的血管生成因子,可選擇性地誘導淋巴管的增生,介導腫瘤的血管生成和淋巴管的生長,與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。BMPs可誘導各種血管活性因子形成并刺激內(nèi)皮細胞的遷移和新生血管的形成,我們的前期研究顯示血管生成因子MMP-2、MMP-9和E-鈣粘蛋白在肝癌中呈不同程度的表達。
　　BMPR-II的許多生理功能是通過信號通路途徑實現(xiàn)。其

4、中絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)是細胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng),我們的前期研究顯示ERK1/2對BMP-2具有調(diào)節(jié)作用。但是BMPs信號通路除了包括ERK1/2信號通路,還包括P38和JNK信號通路。其具體的調(diào)控機制有待探究。
　　本研究擬在前期工作的基礎(chǔ)上,采用細胞水平小片段RNA干擾技術(shù)沉默BMPR-II基因,探討B(tài)MPR-II對肝癌細胞增殖和侵襲的作用及并深層次分

5、析研究BMPR-II參與調(diào)控所涉及到的相關(guān)信號傳導途徑及血管形成機制。本研究以BMPR-II為切入點,揭示肝癌細胞增殖和侵襲的發(fā)生的分子機制;以VEGF-C為目的,進一步細化肝癌侵襲增殖的血管侵犯機制;以信號通路為聯(lián)系,闡明肝癌侵襲增殖的調(diào)控機制。為肝癌的臨床治療探尋新的治療靶點和思路。
　　目的:
　　RNA干擾技術(shù)(RNA interference,RNAi)抑制骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體II(bone mor-phogenet

6、ic protein receptor,BMPR-II)的表達,觀察抑制BMPR-II后對人肝癌細胞侵襲、增殖、凋亡和周期的影響及對VEGF-C相關(guān)的信號通路的影響。
　　方法:
　　1.通過半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)、蛋白印跡(Western Blot)技術(shù)從肝癌細胞株HepG2、SMMC7721和Hep3B中篩選BMPR-II基因高表達細胞株。
　　2.設(shè)計并化學合成針對BMPR-II的3對小干擾RN

7、A(small interfering RNA, siRNA),采用陽離子脂質(zhì)體法瞬間轉(zhuǎn)染。采用離體培養(yǎng)肝癌細胞,并設(shè)Normal Control組、Blank Control組、Negative Control組及 siRNA-BMPR-II-a、siRNA-BMPR-II-b、siRNA-BMPR-II-c轉(zhuǎn)染組。
　　3.通過半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和蛋白印跡(Western Blot)法檢測各組細胞中BMP

8、R-II在mRNA和蛋白水平表達的變化,篩選沉默效果最佳序列。
　　4.運用MTT比色法及Transwell侵襲實驗檢測轉(zhuǎn)染后細胞增殖及侵襲的變化。流式細胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后細胞凋亡和周期的變化。
　　5.運用MAPKs信號通路特異性抑制劑SB203580(P38抑制劑)、PD98059(ERK抑制劑)和SP6000(JNK抑制劑),分別觀察阻斷MAPKs各信號通路前、阻斷后及阻斷加沉默BMPR-II后各相關(guān)蛋白的表達變化。

9、>　　結(jié)果:
　　1.RT-PCR、Western blot顯示,在肝癌細胞HepG2、SMMC7721和Hep3B中, HepG2細胞為BMPR-II基因高表達細胞(1.00±0.04,1.01±0.06 P<0.01)。
　　2.3個特異性siRNA-BMPR-II轉(zhuǎn)染組分別轉(zhuǎn)染24h和48h后,其BMPR-II的mRNA(24h)和蛋白(48h)表達與另外3組比較受到明顯抑制,結(jié)果顯示siRNA-BMPR-II-a轉(zhuǎn)染

10、組抑制效果最明顯(0.20±0.01,0.39±0.02,P<0.01)。
　　3.MTT比色法及Transwell侵襲實驗顯示,轉(zhuǎn)染48h后,siRNA-BMPR-II轉(zhuǎn)染組細胞的生長及穿膜數(shù)(48.27％±0.76%、25.20±1.60,P<0.05)明顯低于正常對照組(82.64%±0.67%、60.40±1.39)及陰性對照組(81.21%±0.80%、59.50±1.85)。
　　4.流式細胞數(shù)實驗顯示,轉(zhuǎn)染48

11、h后,siRNA-BMPR-II轉(zhuǎn)染組細胞凋亡率最高(37.03±0.56,P<0.01)。細胞S期阻滯明顯(50.63±13.09 P<0.01)。
　　5.Western Blot顯示,抑制BMPR-II能夠顯著下調(diào)p-P38(0.45±0.05 P<0.01)、p-ERK(0.35±0.03 P<0.01)和VEGF-C(0.33±0.05 P<0.01)蛋白的表達。PD98059+siBMPR-II group和SB203

12、580+siBMPR-II group VEGF-C蛋白表達下調(diào)顯著(P<0.01),SP600125+siBMPR-IIgroup無明顯變化。其中,SB203580 group VEGF-C蛋白表達較PD9805 group下調(diào)更顯著0.41±0.03 vs0.55±0.03 P<0.01), SB203580+siBMPR-II group VEGF-C蛋白表達較PD98059+siBMPR-II group下調(diào)更顯著(0.34±0

13、.02 vs0.44±0.02 P<0.01)。
　　結(jié)論:
　　1.HepG2、SMMC7721和Hep3B細胞中,HepG2為BMPR-II基因高表達細胞株。
　　2.siRNA干擾介導BMPR-II基因沉默可抑制人肝癌HepG2細胞的增殖和侵襲,促進細胞凋亡,阻滯細胞S期。
　　3.BMPR-II基因沉默通過P38、ERK信號通路途徑下調(diào)VEGF-C的表達。其中,更選擇性的通過P38信號通路下調(diào)VEGF-C