Mcl-1參與NSCLC細(xì)胞對(duì)EGFR和ALK抑制劑敏感性調(diào)控的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、Mcl-1（myeloid cell leukemia-1,Mcl-1）是Bcl-2（B cell lymphoma-2, Bcl-2）抗凋亡蛋白家族成員，參與調(diào)控細(xì)胞的凋亡與存活。Mcl-1在許多正常組織中廣泛表達(dá)，對(duì)維持多種細(xì)胞的成熟與分化具有重要的意義。Mc l-1表達(dá)的上調(diào)提示了腫瘤的發(fā)生，而在多種人類(lèi)癌組織中，Mcl-1確實(shí)存在過(guò)表達(dá)現(xiàn)象。此外，Mcl-1的過(guò)表達(dá)還可以誘導(dǎo)細(xì)胞對(duì)一些治療藥物產(chǎn)生耐受作用。由此可見(jiàn)，作為癌癥靶向

2、新型位點(diǎn)，Mcl-1在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡等抗腫瘤方面可能發(fā)揮重要的作用。本實(shí)驗(yàn)以含EGFR突變的PC-9細(xì)胞系以及含 EML4-ALK基因融合的H3122細(xì)胞系為研究對(duì)象，觀察Mcl-1調(diào)控NSCLC細(xì)胞對(duì)EGFR和ALK抑制劑敏感性的作用及相關(guān)機(jī)制。
　　第一部分：通過(guò)Western blot方法，檢測(cè)EGFR抑制劑和ALK抑制劑誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞凋亡信號(hào)通路以及凋亡過(guò)程中起關(guān)鍵作用的調(diào)控分子。結(jié)果顯示：EGFR和ALK抑制劑通過(guò)

3、調(diào)控Bcl-2家族蛋白的表達(dá)，活化Caspase-3信號(hào)途徑，進(jìn)而誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞凋亡，Mcl-1則作為參與此凋亡信號(hào)通路的一個(gè)關(guān)鍵分子。
　　第二部分：觀察Mcl-1調(diào)控NSCLC細(xì)胞對(duì)EGFR和ALK抑制劑敏感性的作用。實(shí)時(shí)定量PCR、Western blot以及免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)等檢測(cè)Mcl-1的表達(dá)，結(jié)果顯示GFR和ALK抑制劑并非在轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)Mcl-1，而是在蛋白降解水平下調(diào)Mcl-1。過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到臨床上還有一些E

4、GFR野生型病人對(duì)Gefitinib敏感，而對(duì)這些efitinib敏感型細(xì)胞給予Gefitinib處理后Mcl-1表達(dá)下調(diào)。Westernblot檢測(cè)對(duì)efitinib敏感細(xì)胞及耐藥細(xì)胞給予Gefitinib處理后中Mcl-1的表達(dá)及細(xì)胞的凋亡情，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著藥物濃度的增大，敏感細(xì)胞株凋亡片段增多，Mcl-1表達(dá)減少；而藥細(xì)胞株未出現(xiàn)明顯的凋亡片段，Mcl-1的表達(dá)無(wú)明顯減少。特異性敲除耐藥細(xì)胞Mcl-1基因，流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞，結(jié)果

5、顯示細(xì)胞凋亡明顯增多。
　　第三部分：探討Mcl-1調(diào)控EGFR突變細(xì)胞對(duì)EGFR抑制劑敏感性的相關(guān)機(jī)制。Western blot檢測(cè)分別給予Gefitinib、Akt抑制劑以及Erk抑制劑處理后，PC-9細(xì)胞內(nèi)Mcl-1的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：EGFR抑制劑通過(guò)下調(diào)pAkt來(lái)抑制pGSK3β的表達(dá)，使Mcl-1磷酸化水平增加，進(jìn)而被泛素修飾，并經(jīng)泛素化途徑降解。通過(guò)免疫共沉淀以及Western blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證：FBW7是介導(dǎo)Mc