Caveolin-1降低EGFR突變陽性非小細胞肺癌對TKIs的敏感性.pdf

1、目的:
　　肺癌是癌癥相關(guān)死亡的首要原因。其中非小細胞肺癌(non-small celllung cancer，NSCLC)占80％左右，大多數(shù)NSCLC診斷時已經(jīng)屬于晚期，5年生存率不足15％。以鉑類為基礎(chǔ)的兩藥聯(lián)合方案是晚期NSCLC的標準一線化療方案，但是化療有效率低、副作用大，近年來分子靶向治療為晚期NSCLC提供了新的選擇。
　　表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，E

2、GFR)屬于具有酪氨酸激酶活性的HER家族中的一員。HER家族包括四大成員:HER1or EGFR，HER2，HER3及HER4。EGFR與配體特異性結(jié)合，形成同源或異源二聚體，導致EGFR胞內(nèi)區(qū)自動磷酸化及酪氨酸激酶激活，引起下游多條信號轉(zhuǎn)導通路如Ras-Raf-MAPK、PI3K-Akt等激活，促進腫瘤細胞增殖、分化、遷移、侵襲等。目前發(fā)現(xiàn)，EGFR酪氨酸激酶抑制劑(tyrosinekinase inhibitor，TKIs)如吉非

3、替尼、厄洛替尼等對帶有EGFR基因敏感突變包括19外顯子缺失突變、21外顯子(L858R)替代突變的晚期NSCLC病人治療有效，因此，EGFR-TKIs廣泛用于晚期NSCLC的治療，但大部分初始治療有效的病人最終會出現(xiàn)耐藥，提示可能存在其它分子影響EGFR信號通路，在NSCLC中發(fā)揮著重要作用。
　　小凹蛋白-1(caveolin-1，Cav-1)是細胞膜上Caveolae的重要組成蛋白，相對分子量21-24KDa，包括178個氨

4、基酸殘基，C端殘基與N端殘基游離，并且伸入胞質(zhì)內(nèi)，位于肽鏈中間的疏水性氨基酸殘基(102-134)形成發(fā)卡樣結(jié)構(gòu)，將Cav-1錨定在細胞膜上。N端氨基酸殘基為Cav-1的功能區(qū)，該區(qū)域與EGFR結(jié)合，從而參與腫瘤細胞增殖、粘附、遷移和信號轉(zhuǎn)導。因此，推測Cav-1的表達可影響NSCLC對EGFR-TKIs的敏感性。
　　本研究利用帶有EGFR敏感突變的NSCLC細胞株P(guān)C-9，通過:(1)采用Western blot驗證Cav-1

5、過表達的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株。(2)采用MTS比色分析法、劃痕修復試驗、Transwell法檢測厄洛替尼對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株增殖、遷移及侵襲能力的影響;(3)采用Western blot法，檢測厄洛替尼對EGFR及下游信號通路中各激酶活化水平的影響。旨在探討Cav-1的表達是否可影響NSCLC對EGFR-TKIs的敏感性。
　　方法:
　　1、Western bolt驗證Cav-1過表達的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株
　　利用Western

6、bolt方法檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株中Cav-1蛋白水平。
　　2、MTS比色分析法檢測厄洛替尼對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞增殖能力的影響
　　將PC-9/Cav-1及PC-9/pcDNA3.1細胞分別接種于96孔板，次日換用含不同濃度厄洛替尼(0、0.005、0.01、0.02、0.04、0.08、0.16、0.32μmol/L)的完全1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48h，加入MTS溶液，通過測定各孔的吸光度(OD)值，計算細胞生長抑制率和厄洛替尼的

7、半數(shù)抑制濃度(IC50)。
　　3、劃痕修復實驗檢測厄洛替尼對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞遷移能力的影響
　　將PC-9/Cav-1及PC-9/pcDNA3.1細胞分別接種于24孔板，24h后用10μl移液器吸頭劃痕，PBS洗去漂浮的細胞，兩種細胞都分別于完全1640培養(yǎng)液及含濃度為0.04μmol/L厄洛替尼的完全1640培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)，在倒置顯微鏡下觀察并拍照，每6h拍照一次，直至劃痕愈合，測量劃痕寬度變化，計算細胞遷移率。遷移率=（

8、劃痕初始寬度-目前寬度）/2/劃痕初始寬度×100％。
　　4、Transwell法檢測厄洛替尼對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞侵襲能力的影響
　　鋪基質(zhì)膠于Transwell小室的上室，將PC-9/Cav-1及PC-9/pcDNA3.1細胞分別接種于上室，兩種細胞都分別于無胎牛血清的1640培養(yǎng)液及含濃度為0.04μmol/L厄洛替尼的無胎牛血清1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，下室放入含10％胎牛血清的1640培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48h后，95％冰乙醇固

9、定，HE染色，顯微鏡下拍照，每個小室隨機選取上、下、左、右及中心共5個視野，計算穿膜細胞數(shù)。
　　5、Western blot檢測厄洛替尼對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞EGFR活化水平及其下游信號通路分子的影響
　　將PC-9/Cav-1及PC-9/pcDNA3.1細胞分別接種于35mm培養(yǎng)皿，予以濃度為0.04μmol/L厄洛替尼進行藥物干預，分別于0h、4h后，收集細胞，提取總蛋白，Western blot檢測pY-EGFR、EGFR、

10、p-ERK、ERK、p-Akt、Akt、Cav-1的蛋白水平，β-actin作為內(nèi)參蛋白。
　　結(jié)果:
　　1、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞Cav-1蛋白水平
　　采用Western blot檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞Cav-1蛋白水平，結(jié)果顯示:PC-9/Cav-1細胞Cav-1蛋白的相對表達量（1.74±0.06）明顯高于PC-9/pcDNA3.1細胞（0.61±0.99），差異有統(tǒng)計學意義。(P＜0.05)
　　2、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞對厄

11、洛替尼敏感性的變化
　　2.1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞厄洛替尼的IC50
　　MTS法檢測厄洛替尼對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞增殖能力的影響，結(jié)果顯示:給予不同濃度厄洛替尼作用的PC-9/Cav-1細胞的生長抑制率均低于相應濃度的PC-9/pcDNA3.1細胞，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);PC-9/Cav-1組厄洛替尼的IC50值（0.06±0.01）明顯高于PC-9/pcDNA3.1組（0.03±0.01），差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

12、表明PC-9/Cav-1細胞對厄洛替尼的敏感性低于PC-9/pcDNA3.1細胞。
　　2.2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞遷移能力的變化及對厄洛替尼作用的影響
　　劃痕修復實驗檢測細胞遷移能力的結(jié)果顯示:在無厄洛替尼作用下，PC-9/Cav-1組細胞6h、12h、18h的遷移率（14.81±0.84％，27.98±0.73％，39.34±0.54％）均明顯高于PC-9/pcDNA3.1組（12.89±0.81％，19.93±1.99％，26

13、.07±0.68％），均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);在0.04μmol/L厄洛替尼作用下，PC-9/Cav-1組細胞6h、12h、18h的遷移率（10.66±1.19％，14.61±2.23％，19.77±0.83％）明顯高于PC-9/pcDNA3.1組細胞(4.80±1.04％，9.34±1.77％，14.14±2.61％)，均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　2.3穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞侵襲能力的變化及對厄洛替尼作用的影響
　

14、　Transwell法檢測細胞侵襲能力的結(jié)果顯示:在0μmol/L厄洛替尼作用下的PC-9/Cav-1組穿膜細胞數(shù)(79.00±4.60)明顯多于PC-9/pcDNA3.1組(56.33±6.50)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);在0.04μmol/L厄洛替尼作用下的PC-9/Cav-1組穿膜細胞數(shù)(49.00±3.60)明顯多于PC-9/pcDNA3.1組(34.33±4.90)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　3、

15、厄洛替尼對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞EGFR活化水平及其下游信號通路分子的影響
　　Western blot檢測0μmol/L、0.04μmol/L厄洛替尼作用后穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞中各蛋白的表達水平，經(jīng)灰度掃描，結(jié)果顯示:0μmol/L、0.04μmol/L厄洛替尼作用后，PC-9/Cav-1組pY-EGFR的水平（2.25±0.29，2.01±0.13）均明顯高于PC-9/pcDNA3.1組（1.54±0.09，1.02±0.05），均有統(tǒng)計學意義

16、（P＜0.05）;PC-9/Cav-1組p-ERK的水平（2.24±0.05，0.80±0.15）均明顯高于PC-9/pcDNA3.1組（1.36±0.02，0.28±0.02），均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);PC-9/Cav-1組p-Akt的水平（0.83±0.02，0.64±0.01）明顯高于PC-9/pcDNA3.1組（0.52±0.03，0.30±0.03），均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、C