Caveolin-1EGFR突變非小細胞肺癌酪氨酸激酶抑制劑敏感性的影響.pdf

1、目的:肺癌是當今全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，每年新增患者人數(shù)為120萬，其中80％-85％為非小細胞肺癌(non-small celllung cancer, NSCLC)。大多數(shù)NSCLC患者在初診時已為晚期。晚期肺癌標準一線化療方案為含鉑雙藥方案，其在延長患者的總生存期、提高患者生存質(zhì)量等方面均不理想。近年來隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，分子靶向藥物以其特異性強、療效明顯、副反應(yīng)小等優(yōu)點在晚期NSCLC的治療中被廣泛應(yīng)用。

2、>　　表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)是具有酪氨酸激酶活性的ErbB(HER)家族中的一員。表皮生長因子受體家族包括:ErbB1(EGFR)、ErbB2(HER2)、ErbB3(HER3)、ErbB4(HER4)四個成員。其中EGFR在40-80％的NSCLC中異?；罨珽GFR異?；罨Ｌ崾绢A(yù)后不佳。EGFR通過與其配體結(jié)合，形成二聚體，進而激活胞內(nèi)段的酪氨酸激酶區(qū)，最終

3、激活多條受體介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化和存活。表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（epidermal growthfactor receptor tyrosine kinase inhibitors，EGFR-TKIs）通過與ATP競爭性結(jié)合EGFR胞內(nèi)段酪氨酸激酶區(qū)域的ATP結(jié)合位點，阻止配體與受體結(jié)合后引起的酪氨酸激酶的磷酸化，抑制EGF與EGFR結(jié)合后觸發(fā)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進而達到抑制腫瘤生長的目的。吉非替尼(Gefit

4、inib)是目前最常用于治療晚期具有EGFR突變NSCLC的EGFR-TKI。但在吉非替尼的應(yīng)用中，大多數(shù)患者在1年內(nèi)都會出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象。目前公認的對吉非替尼耐藥的主要原因為T790M突變和c-MET基因擴增。但仍有其它的耐藥機制尚未查明。
　　小凹蛋白-1(caveolin-1，Cav-1)是分子量為21-24KDa的膜內(nèi)在蛋白，是膜內(nèi)陷囊泡(caveolae)的重要標志性結(jié)構(gòu)蛋白。Cav-1由178個氨基酸殘基組成，中間的疏水殘

5、基(102-134)在膜結(jié)構(gòu)上形成特殊的發(fā)卡樣鑲嵌在細胞膜內(nèi)，將Cav-1蛋白分成N端及C端兩個區(qū)域，其中N端的82-101殘基為主要的功能區(qū)域，該區(qū)域通過與EGFR相連接，從而調(diào)控EGFR酪氨酸激酶的活性。因此，我們推測Cav-1可能對具有EGFR突變的NSCLC酪氨酸激酶抑制劑敏感性產(chǎn)生影響。
　　為證實上述設(shè)想，本研究利用體外培養(yǎng)具有EGFR突變的NSCLC細胞PC-9，通過:(1)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)，建立過表達Cav-1的穩(wěn)定細

6、胞株;(2)MTT比色分析法、劃痕修復(fù)實驗、Transwell法檢測吉非替尼對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞增殖、遷移和侵襲能力的影響;(3) Western blot法檢測吉非替尼對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞EGFR及其下游信號通路中各激酶活化水平的影響。旨在從細胞、分子水平探討Cav-1影響EGFR突變NSCLC細胞PC-9酪氨酸激酶抑制劑敏感性的作用機制，為解決EGFR-TKIs耐藥問題提供新靶點。
　　方法:
　　1.質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)建立過表達Cav-

7、1的穩(wěn)定細胞株將含人全長Cav-1基因的pcDNA3.1質(zhì)粒和空質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染人NSCLC細胞PC-9，經(jīng)G418抗性篩選，得到過表達Cav-1的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株(PC-9/Cav-1)及其對照組細胞（PC-9/pcDNA3.1）;利用實時定量PCR和Western blot檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株中Cav-1 mRNA和Cav-1蛋白的水平。
　　2.MTT比色分析法檢測吉非替尼對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞增殖能力的影響將PC-9/Cav-1及PC-9

8、/pcDNA3.1細胞分別接種于96孔板，次日換用含不同濃度吉非替尼(0、0.04、0.08、0.16、0.32、0.64、1.28、2.56μmol/L)的完全1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，結(jié)束前4h加入MTT，通過測定各孔的吸光度(OD)值，計算細胞生長抑制率和吉非替尼的半數(shù)抑制濃度(IC50)。
　　3.劃痕修復(fù)實驗檢測吉非替尼對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株遷移能力的影響將PC-9/Cav-1及PC-9/pcDNA3.1細胞分別接種于24孔板，

9、待細胞貼壁生長達80-90％時，用10μl移液器吸頭劃痕，PBS洗去漂浮的細胞，兩種細胞都分別于完全1640培養(yǎng)液及含濃度為0.015μmol/L吉非替尼的完全1640培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)，在倒置顯微鏡下觀察并拍照，每6h拍照一次，直至劃痕愈合，測量劃痕寬度變化，計算細胞遷移率。遷移率=（劃痕初始寬度—目前寬度）/2/劃痕初始寬度×100％。
　　4.Transwell法檢測吉非替尼對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞侵襲能力的影響鋪基質(zhì)膠于Transwe

10、ll小室的上室，將PC-9/Cav-1及PC-9/pcDNA3.1細胞分別接種子上室，兩種細胞都分別于無胎牛血清的1640培養(yǎng)液及含濃度為0.015μmol/L吉非替尼的無胎牛血清1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，下室放入含10％胎牛血清的1640培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24h后，95％冰乙醇固定，HE染色，顯微鏡下拍照，每個小室隨機選取上、下、左、右及中心共5個視野，計算穿膜細胞數(shù)。
　　5.Western blot檢測吉非替尼對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞EGF

11、R活化水平及其下游信號通路分子的影響將PC-9/Cav-1及PC-9/pcDNA3.1細胞分別接種于35mm培養(yǎng)皿，予以濃度為0.015μmol/L吉非替尼進行藥物干預(yù)，分別于0h、8h后，收集細胞，提取總蛋白，Western blot檢測p-EGFR、EGFR、p-ERK、ERK、p-Akt、Akt、Cav-1的蛋白水平，β-actin作為內(nèi)參蛋白。
　　結(jié)果:
　　1.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞中Cav-1的水平檢測
　　1.1

12、 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞Cav-1 mRNA水平的變化實時定量PCR檢測結(jié)果顯示，PC-9/Cav-1細胞Cav-1 mRNA的相對定量值（4.07±0.08）明顯高于PC-9/pcDNA3.1細胞(1.04±0.09)，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。
　　1.2 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞Cav-1蛋白水平的變化Western blot檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞Cav-1的蛋白水平，蛋白條帶經(jīng)灰度掃描定量及統(tǒng)計分析，PC-9/Cav-1細胞Cav-1蛋白的相對表

13、達量（2.51±0.08）明顯高于PC-9/pcDNA3.1細胞（0.19±0.01），有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。
　　2.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞吉非替尼敏感性的變化
　　2.1 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞吉非替尼的IC50MTT法檢測吉非替尼對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞的增殖能力的影響，結(jié)果顯示:給予不同濃度吉非替尼作用的PC-9/Cav-1細胞的生長抑制率均低于相應(yīng)濃度的PC-9/pcDNA3.1細胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05); PC-9/Cav

14、-1組吉非替尼的IC50值（0.04±0.01）明顯高于PC-9/pcDNA3.1組(0.015±0.01)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。表明PC-9/Cav-1細胞對吉非替尼的敏感性低于PC-9/pcDNA3.1細胞。
　　2.2 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞遷移能力的變化及吉非替尼對其的影響劃痕修復(fù)實驗檢測細胞遷移能力的結(jié)果顯示:在無吉非替尼作用下，PC-9/Cav-1組細胞6h、12h、18h的遷移率(20.10±0.01％，26.6

15、4±0.01％，50.00±0.00％)均明顯高于PC-9/pcDNA3.1組(15.25±0.00％，20.44±0.02％，22.47±0.01％)，均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）;在0.015μmol/L吉非替尼作用下，PC-9/Cav-1組細胞6h、12h、18h的遷移率（14.89±0.02％，22.44±0.01，25.08±0.02％）明顯高于PC-9/pcDNA3.1組細胞（5.61±0.01％，9.90±0.02％，

16、12.10±0.00％），均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。
　　2.3 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞侵襲能力的變化及吉非替尼對其的影響Transwell法檢測細胞侵襲能力的結(jié)果顯示:無吉非替尼作用的PC-9/Cav-1組穿膜細胞數(shù)(93.00±11.68)明顯多于PC-9/pcDNA3.1組(66.40±6.02)，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);在0.015μmol/L吉非替尼作用下，PC-9/Cav-1組穿膜細胞數(shù)(56.20±4.87)明顯多

17、于PC-9/pcDNA3.1組細胞(23.20±3.19)，有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。
　　3.吉非替尼對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞EGFR活化水平及其下游信號通路分子的影響Western blot檢測0μmol/L、0.015μmol/L吉非替尼作用后穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞中各蛋白的表達水平，經(jīng)灰度掃描，結(jié)果顯示:0μmol/L、0.015μmol/L吉非替尼作用后，PC-9/Cav-1組p-EGFR的水平（1.22±0.02，1.03±0.01）

18、均明顯高于PC-9/pcDNA3.1組（0.74±0.04，0.51±0.02），均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);PC-9/Cav-1組p-ERK的水平（0.42±0.00，0.18±0.00）均明顯高于PC-9/pcDNA3.1組（0.22±0.01，0.04±0.01），均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);PC-9/Cav-1組p-Akt的水平（1.88±0.30，0.56±0.04）明顯高于PC-9/pcDNA3.1組（1.27±0.

19、17，0.28±0.04），均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。
　　結(jié)論:
　　1.增強Cav-1的表達水平可促進EGFR突變NSCLC PC-9細胞的增殖、遷移和侵襲;Cav-1通過調(diào)控PC-9細胞EGFR的活化（磷酸化）水平，影響MAPK/ERK及PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激酶的活化，進而影響PC-9細胞的生物學(xué)行為。
　　2.Cav-1通過減弱吉非替尼對PC-9細胞EGFR及其下游MAPK/ERK和PI3K/Ak