Caveolin-1對(duì)EGFR突變陽性肺腺癌EGFR-TKIs敏感性的影響.pdf

1、肺癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率一直位居首位的惡性腫瘤。非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占所有肺癌總數(shù)的85％左右，而肺腺癌是其中最常見的病理類型。盡管肺癌的早期檢測(cè)有了巨大的提升，但大部分患者被確診時(shí)已屬于肺癌晚期，從而導(dǎo)致預(yù)后不良。
　　表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor， EGFR）在40%-80%的NSCLC中呈現(xiàn)過表達(dá)，其同源或

2、異源二聚體化和自身磷酸化都會(huì)激活下游的MAPK和PI3K信號(hào)通路，從而引起細(xì)胞過度生長(zhǎng)，生存和轉(zhuǎn)移。以EGFR為靶點(diǎn)的酪氨酸激酶抑制劑（tyrosin kinase inhibitors， TKIs）可通過與ATP競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合EGFR酪氨酸激酶域從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。因此，EGFR-TKIs已成為EGFR突變陽性的肺腺癌治療的有效手段。且有研究證實(shí)腫瘤細(xì)胞中EGFR-TKIs的敏感性和EGFR基因的突變類型相關(guān)，其敏感突變?yōu)?9外顯子缺

3、失突變（delE746-A750）、18外顯子點(diǎn)突變（L858R）和21外顯子點(diǎn)突變（G719S）。因此，EGFR-TKIs已成為EGFR敏感突變型晚期NSCLC患者的一線用藥方案。然而， EGFR-TKIs療效存在明顯的個(gè)體差異，約25%帶有EGFR敏感突變類型的患者對(duì)EGFR-TKIs不敏感或治療無反應(yīng)，即發(fā)生原發(fā)耐藥。而且即使對(duì)EGFR-TKIs治療起初有效的患者，其臨床療效也不盡一致，且最終都不可避免的出現(xiàn)獲得性耐藥。雖然針對(duì)E

4、GFR突變本身（T790M）、EGFR通路相關(guān)分子（c-MET擴(kuò)增）以及其他通路分子的研究已部分證實(shí)均和EGFR-TKIs耐藥有關(guān)，但尚不足解釋EGFR-TKIs在EGFR基因突變肺腺癌患者中的療效差異。
　　小凹蛋白（Caveolin-1，Cav-1）是細(xì)胞質(zhì)膜表面特異性膜內(nèi)陷囊泡的重要標(biāo)志性結(jié)構(gòu)蛋白，分子量21-24kDa。Cav-1可以通過其微囊中的腳手架結(jié)合域和許多信號(hào)蛋白結(jié)合（EGFR、ErbB2、H-Ras、MEK等）

5、從而影響和調(diào)控其下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞一系列生物學(xué)行為的改變。許多研究證實(shí)Cav-1在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著非常重要的作用。我們的前期實(shí)驗(yàn)也已證實(shí)，在肺腺癌細(xì)胞中，Cav-1通過影響EGFR的磷酸化調(diào)節(jié)其下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而影響肺腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲等能力。另外，有研究顯示Cav-1與腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥和對(duì)化療藥的敏感性有關(guān)，且在許多耐藥的腫瘤細(xì)胞中Cav-1呈現(xiàn)高表達(dá)。但目前為止關(guān)于Cav-1是否影響分子靶向藥的敏感性尚未見

6、報(bào)道。
　　本研究通過臨床結(jié)合細(xì)胞學(xué)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究以期明確（1）Cav-1表達(dá)量是否與肺腺癌對(duì)EGFR-TKIs的敏感性有關(guān)。（2）Cav-1影響肺腺癌EGFR-TKIs敏感性的分子機(jī)制。為臨床解釋EGFR-TKIs療效的個(gè)體差異提供可能的理論依據(jù)，為臨床精準(zhǔn)選擇EGFR-TKIs藥物提供新的生物標(biāo)記物，為臨床研發(fā)克服EGFR-TKIs耐藥的新藥提供新靶點(diǎn)。
　　第一部分：Caveolin-1在EGFR突變陽性晚期肺腺癌組織

7、中的表達(dá)及其與吉非替尼療效的相關(guān)性研究
　　目的：明確Cav-1在EGFR突變陽性晚期肺腺癌組織中的表達(dá)以及探討其與吉非替尼療效的相關(guān)性。
　　方法：
　　1.臨床標(biāo)本
　　選取中國(guó)人民解放軍白求恩國(guó)際和平醫(yī)院2011年7月-2014年7月收治的接受吉非替尼一線治療的EGFR突變陽性（19外顯子缺失突變）的晚期（IIIB或IV期）肺腺癌患者標(biāo)本20例。近期療效評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)按照實(shí)體腫瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)（Response E

8、valuation Criteria in Solid Tumors, RECIST1.1），分為完全緩解（Complete Response, CR）、部分緩解（Partial Response, PR）、疾病穩(wěn)定（Stable Disease, SD）和疾病進(jìn)展（Progressive Disease, PD）。遠(yuǎn)期療效為無疾病進(jìn)展時(shí)間（Progression Free Survival, PFS）和總生存期（Overall Sur

9、vival, OS）。
　　2.免疫組化
　　將福爾馬林固定、石蠟包埋的蠟塊制成5μm的連續(xù)切片，孵育Cav-1和Ki-67抗體后進(jìn)行免疫染色。免疫組化的結(jié)果由兩位有經(jīng)驗(yàn)的病理科大夫利用雙盲法進(jìn)行評(píng)分。采用H指數(shù)分析Cav-1表達(dá)情況可綜合考慮染色強(qiáng)度和密度，其中染色強(qiáng)度分為0-3四個(gè)等級(jí)；染色密度有低至高分別記為0-100。最終H指數(shù)由以下公式計(jì)算得出：H指數(shù)=(染色強(qiáng)度為1細(xì)胞面積%×1)+(染色強(qiáng)度為2細(xì)胞面積%×2)

10、+(染色強(qiáng)度為3細(xì)胞面積%×3)。Ki-67陽性信號(hào)為細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色細(xì)小顆粒，計(jì)數(shù)500個(gè)腫瘤細(xì)胞中陽性細(xì)胞所占百分比來計(jì)算平均陽性率。
　　結(jié)果：
　　1.Cav-1在肺腺癌組織中的表達(dá)
　　光鏡下觀察Cav-1染色情況，可見其分布于細(xì)胞膜和細(xì)胞漿，而Ki-67分布于細(xì)胞核。通過H評(píng)分和線性相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)在肺腺癌組織中，Cav-1表達(dá)與Ki-67表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.71;P<0.05）。
　　2.高表達(dá)C

11、av-1預(yù)示吉非替尼療效不佳及PFS較短
　　根據(jù)患者的病理特征分組分析發(fā)現(xiàn)，這些病理特征與Cav-1的表達(dá)水平并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），但根據(jù)吉非替尼治療的疾病反應(yīng)率、PFS和OS分組的分析發(fā)現(xiàn)，其與Cav-1的表達(dá)水平均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。經(jīng)吉非替尼治療后，所有患者的總緩解率達(dá)60%，且（CR+PR）組的病人中Cav-1的評(píng)分明顯低于（SD+PD）組。此外，所有患者的中位PFS為8個(gè)月（95%CI:6.910

12、-9.090），且患者PFS較短的分組中Cav-1的評(píng)分明顯高于PFS較長(zhǎng)組；所有患者的中位OS為16.5個(gè)月（95%CI:13.578-19.422），且患者OS較短的分組中Cav-1的評(píng)分明顯高于OS較長(zhǎng)組。以所有患者組織標(biāo)本中Cav-1評(píng)分的中位數(shù)為截?cái)嘀?，將患者分為Cav-1高表達(dá)組和低表達(dá)組。通過分析發(fā)現(xiàn)，Cav-1高表達(dá)組中患者的總緩解率明顯低于Cav-1低表達(dá)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；Cav-1高表達(dá)組中患者

13、的PFS明顯短于Cav-1低表達(dá)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；而兩組間的OS并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。
　　第二部分：敲低 Caveolin-1的表達(dá)對(duì) EGFR突變陽性肺腺癌細(xì)胞EGFR-TKIs敏感性的影響
　　目的：探討敲低Cav-1的表達(dá)對(duì)EGFR突變陽性肺腺癌細(xì)胞EGFR-TKIs敏感性的影響。
　　方法：
　　1.細(xì)胞轉(zhuǎn)染
　　選取對(duì)EGFR-TKIs敏感的中量表達(dá)Cav-1的P

14、C-9細(xì)胞，分別轉(zhuǎn)染Control shRNA或Cav-1 shRNA質(zhì)粒，嘌呤霉素進(jìn)行抗性篩選，構(gòu)建正常表達(dá)Cav-1的PC-9/Ctrl和低表達(dá)Cav-1的PC-9/KD細(xì)胞。
　　2.增殖抑制實(shí)驗(yàn)
　　將細(xì)胞接種于96孔板，過夜貼壁后分別用不同濃度的EGFR-TKIs（吉非替尼和厄洛替尼）處理，培養(yǎng)一定的時(shí)間后上機(jī)檢測(cè)吸光度值（OD）。半數(shù)抑制濃度（half maximal inhibitory concentrati

15、on, IC50）定義為細(xì)胞抑制達(dá)50%時(shí)的藥物濃度。而后，以每對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中較低的IC50來處理細(xì)胞，檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)（24h、48h、72h）的細(xì)胞抑制率。
　　3.克隆形成實(shí)驗(yàn)
　　克隆形成實(shí)驗(yàn)是以一種細(xì)胞不相互接觸的方式來檢測(cè)細(xì)胞增殖快慢的實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞以低密度接種，300個(gè)/培養(yǎng)皿，在有或無EGFR-TKIs的環(huán)境中培養(yǎng)，8-12天后可觀察到肉眼可見的克隆，蘇木素染色后進(jìn)行計(jì)數(shù)。
　　4.劃痕實(shí)驗(yàn)
　　將細(xì)胞接

16、種于24孔板，過夜貼壁后形成單細(xì)胞層，移液器槍頭進(jìn)行劃痕，在有或無EGFR-TKIs的環(huán)境中培養(yǎng)，不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行拍照直到劃痕愈合。
　　5.侵襲實(shí)驗(yàn)
　　將稀釋后的基質(zhì)膠鋪于小室的上室，當(dāng)膠凝固后加入有或無EGFR-TKIs處理的細(xì)胞，下室加入適量完全1640培養(yǎng)基。培養(yǎng)24h后，將穿膜的細(xì)胞進(jìn)行HE染色，顯微鏡下拍照和計(jì)數(shù)。
　　6.蛋白印跡
　　將有或無EGFR-TKIs處理的細(xì)胞裂解和定量后，10%SDS-

17、PAGE分離蛋白、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉或3%牛血清白蛋白封閉、一抗4℃過夜孵育、二抗常溫孵育1h，最后ECL試劑盒進(jìn)行顯色。
　　7.免疫共沉淀
　　將裂解后的細(xì)胞蛋白分別用抗EGFR和抗Cav-1的抗體進(jìn)行免疫沉淀，4℃過夜孵育。然后在每管樣品中加入40?l蛋白G瓊脂糖微珠，4℃滾動(dòng)混勻2h。蛋白印跡分別檢測(cè)蛋白裂解液和免疫沉淀復(fù)合物中EGFR和Cav-1蛋白的表達(dá)。
　　8.激光共聚焦
　　將細(xì)胞接種到提前置入

18、蓋玻片的培養(yǎng)皿中，4%多聚甲醛固定20min，0.1%TritonX-100透化10min，8%BSA封閉1h，抗Cav-1和抗EGFR抗體同時(shí)加到載玻片上4℃過夜孵育，熒光二抗Alexa Flour488羊抗鼠 IgG和Alexa Flour555羊抗兔IgG同時(shí)加到載玻片上37℃避光孵育1h。DAPI染核室溫避光孵育5min。激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞染色情況并拍照9體內(nèi)實(shí)驗(yàn)
　　5周齡裸鼠右背部皮下接種細(xì)胞，每周測(cè)量瘤徑,計(jì)

19、算腫瘤體積：瘤體積=1/2×長(zhǎng)徑×短徑2。當(dāng)瘤體積達(dá)40mm3時(shí)，將各組裸鼠分別分為加藥組（吉非替尼6mg/kg）和不加藥組（相同體積的滅菌水）。灌胃4周后脫頸處死裸鼠，稱量瘤重并計(jì)算抑瘤率。每只裸鼠的瘤組織用于后續(xù)蛋白印跡和免疫組織化學(xué)
　　結(jié)果：
　　1.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的構(gòu)建
　　PC-9/KD細(xì)胞中Cav-1的相對(duì)表達(dá)量明顯低于PC-9親本株和PC-9/Ctrl細(xì)胞，差異均有顯著性（P<0.05）。結(jié)果證實(shí)：敲低

20、Cav-1表達(dá)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株構(gòu)建成功。
　　2.敲低Cav-1的表達(dá)增強(qiáng)PC-9細(xì)胞對(duì)EGFR-TKIs的敏感性
　　MTS法檢測(cè)Cav-1表達(dá)對(duì)PC-9細(xì)胞EGFR-TKIs敏感性的影響，結(jié)果顯示：在不同濃度EGFR-TKIs作用時(shí)，無論吉非替尼還是厄洛替尼， PC-9/KD細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率明顯高于PC-9/Ctrl細(xì)胞，差異均有顯著性（P<0.05），且隨濃度的遞增，細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率也增加。PC-9/KD細(xì)胞的IC50

21、值明顯低于PC-9/Ctrl細(xì)胞，差異均有顯著性（P<0.05）。在不同時(shí)間點(diǎn)（24h、48h、72h）作用下，PC-9/KD細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率同樣明顯高于PC-9/Ctrl細(xì)胞，差異均有顯著性（P<0.05），且隨著時(shí)間點(diǎn)的延長(zhǎng)，細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率也增加。結(jié)果證實(shí)：EGFR-TKIs對(duì)PC-9的抑制作用具有時(shí)效性和量效性；敲低Cav-1表達(dá)增強(qiáng)PC-9細(xì)胞對(duì)EGFR-TKIs的敏感性。
　　3.敲低Cav-1的表達(dá)抑制PC-9細(xì)胞的

22、增殖、遷移和侵襲，增強(qiáng)EGFR-TKIs對(duì)細(xì)胞生物學(xué)行為的抑制效應(yīng)
　　無EGFR-TKIs作用時(shí)，PC-9/KD細(xì)胞的克隆形成率明顯低于PC-9/Ctrl細(xì)胞，差異均有顯著性（P<0.05）。在EGFR-TKIs作用時(shí)，無論吉非替尼還是厄洛替尼，EGFR-TKIs對(duì)PC-9/KD細(xì)胞克隆形成的抑制效應(yīng)明顯強(qiáng)于PC-9/Ctrl細(xì)胞，差異均有顯著性（P<0.05）。無EGFR-TKIs作用時(shí)，PC-9/KD細(xì)胞的劃痕愈合時(shí)間明顯長(zhǎng)

23、于PC-9/Ctrl細(xì)胞，差異均有顯著性（P<0.05）。在EGFR-TKIs作用時(shí)，無論吉非替尼還是厄洛替尼， EGFR-TKIs對(duì)PC-9/KD細(xì)胞劃痕愈合的抑制效應(yīng)明顯強(qiáng)于PC-9/Ctrl細(xì)胞，差異均有顯著性（P<0.05）。無EGFR-TKIs作用時(shí)，PC-9/KD細(xì)胞的穿膜數(shù)明顯少于PC-9/Ctrl細(xì)胞，差異均有顯著性（P<0.05）。在EGFR-TKIs作用時(shí)，無論吉非替尼還是厄洛替尼，EGFR-TKIs對(duì)PC-9/KD

24、細(xì)胞侵襲能力的抑制效應(yīng)明顯強(qiáng)于PC-9/Ctrl細(xì)胞，差異均有顯著性（P<0.05）。結(jié)果證實(shí)：敲低Cav-1表達(dá)抑制PC-9細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，增強(qiáng)EGFR-TKIs對(duì)其抑制的效應(yīng)。
　　4.敲低Cav-1的表達(dá)通過抑制EGFR的活化增強(qiáng)PC-9細(xì)胞對(duì)EGFR-TKIs的敏感性
　　無EGFR-TKIs作用時(shí)，PC-9/KD細(xì)胞中p-EGFR、p-Akt、p-Erk的相對(duì)水平明顯低于PC-9/Ctrl細(xì)胞，差異均有顯著

25、性（P<0.05）。在有EGFR-TKIs作用時(shí)，無論吉非替尼還是厄洛替尼，EGFR-TKIs對(duì)PC-9/KD細(xì)胞中p-EGFR、p-Akt、p-Erk表達(dá)水平的抑制效應(yīng)明顯強(qiáng)于PC-9/Ctrl細(xì)胞，差異均有顯著性（P<0.05）。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)Cav-1和EGFR可以直接結(jié)合。激光共聚焦顯微鏡下觀察到細(xì)胞膜和細(xì)胞漿處紅色區(qū)域代表Cav-1表達(dá)，綠色區(qū)域代表EGFR表達(dá)，將兩者merge后的黃色代表Cav-1和EGFR共定位。結(jié)果

26、證實(shí)：敲低Cav-1表達(dá)降低PC-9細(xì)胞中MAPK和PI3K信號(hào)通路活化蛋白的表達(dá)，增強(qiáng)EGFR-TKIs敏感性。
　　5.敲低Cav-1的表達(dá)抑制裸鼠腫瘤組織的生長(zhǎng)
　　PC-9/KD組裸鼠腫瘤體積明顯小于PC-9/Ctrl組，差異均有顯著性（P<0.05）；PC-9/KD組裸鼠腫瘤重量明顯輕于PC-9/Ctrl組，差異均有顯著性（P<0.05）。
　　6.敲低Cav-1的表達(dá)增強(qiáng)肺腺癌腫瘤組織對(duì)吉非替尼的敏感性

27、r>　　在吉非替尼灌胃2周后， PC-9/KD組的裸鼠腫瘤體積開始縮小，而PC-9/Ctrl組的裸鼠腫瘤體積呈緩慢增長(zhǎng)的趨勢(shì)，差異均有顯著性（P<0.05）。PC-9/KD組的抑瘤率明顯大于PC-9/Ctrl組，差異均有顯著性（P<0.05）。Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Cav-1表達(dá)對(duì)瘤組織中MAPK和PI3K信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果同體外實(shí)驗(yàn)一致。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示：PC-9/KD組中Cav-1和Ki-67的表達(dá)水平明顯低

28、于PC-9/Ctrl組；無吉非替尼作用時(shí)，Cav-1的表達(dá)水平與Ki-67存在正相關(guān)；有吉非替尼作用時(shí)，Ki-67的表達(dá)水平明顯下降。
　　第三部分：過表達(dá)Caveolin-1對(duì)EGFR突變陽性肺腺癌細(xì)胞EGFR-TKIs敏感性的影響
　　目的：探討過表達(dá)Cav-1對(duì)EGFR突變陽性肺腺癌細(xì)胞EGFR-TKIs敏感性的影響。
　　方法：
　　1.細(xì)胞轉(zhuǎn)染
　　選取對(duì)EGFR-TKIs敏感的中量表達(dá)Cav-1

29、的PC-9細(xì)胞，分別轉(zhuǎn)染pcDNA3.1或pcDNA3.1/Cav-1質(zhì)粒，G418進(jìn)行抗性篩選，構(gòu)建正常表達(dá)Cav-1的PC-9/pcDNA3.1和過表達(dá)Cav-1的PC-9/Cav-1細(xì)胞。
　　2.其余方法同第二部分。
　　結(jié)果：
　　1.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的構(gòu)建
　　PC-9/Cav-1細(xì)胞中Cav-1的相對(duì)表達(dá)量明顯高于PC-9親本株和PC-9/pcDNA3.1細(xì)胞，差異均有顯著性（P<0.05）。結(jié)果證實(shí)

30、：過表達(dá)Cav-1的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株構(gòu)建成功。
　　2.過表達(dá)Cav-1降低PC-9細(xì)胞對(duì)EGFR-TKIs的敏感性
　　MTS法檢測(cè)Cav-1表達(dá)對(duì)PC-9細(xì)胞EGFR-TKIs敏感性的影響，結(jié)果顯示：在不同濃度EGFR-TKIs作用時(shí)，無論吉非替尼還是厄洛替尼， PC-9/Cav-1細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率明顯低于PC-9/pcDNA3.1細(xì)胞，差異均有顯著性（P<0.05），且隨濃度的遞增，細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率也增加。PC-9/Ca

31、v-1細(xì)胞的IC50值明顯高于PC-9/pcDNA3.1細(xì)胞，差異均有顯著性（P<0.05）。在不同時(shí)間點(diǎn)（24h、48h、72h）作用下， PC-9/Cav-1細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率同樣明顯低于PC-9/pcDNA3.1細(xì)胞，差異均有顯著性（P<0.05），且隨著時(shí)間點(diǎn)的延長(zhǎng)，細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率也增加。結(jié)果證實(shí)：EGFR-TKIs對(duì)PC-9的抑制作用具有時(shí)效性和量效性；過表達(dá)Cav-1降低PC-9細(xì)胞對(duì)EGFR-TKIs的敏感性。
　　

32、3.過表達(dá)Cav-1促進(jìn)PC-9細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，降低EGFR-TKIs對(duì)細(xì)胞生物學(xué)行為的抑制效應(yīng)
　　無EGFR-TKIs作用時(shí)， PC-9/Cav-1細(xì)胞的克隆形成率明顯高于PC-9/pcDNA3.1細(xì)胞，差異均具有顯著性（P<0.05）。在EGFR-TKIs作用時(shí)，無論吉非替尼還是厄洛替尼，EGFR-TKIs對(duì)PC-9/Cav-1細(xì)胞克隆形成的抑制效應(yīng)明顯弱于PC-9/pcDNA3.1細(xì)胞，差異均具有顯著性（P<0.0

33、5）。無EGFR-TKIs作用時(shí)， PC-9/Cav-1細(xì)胞的劃痕愈合時(shí)間明顯短于PC-9/pcDNA3.1細(xì)胞，差異均具有顯著性（P<0.05）。在EGFR-TKIs作用時(shí)，無論吉非替尼還是厄洛替尼，EGFR-TKIs對(duì)PC-9/Cav-1細(xì)胞劃痕愈合的抑制效應(yīng)明顯弱于PC-9/pcDNA3.1細(xì)胞，差異均具有顯著性（P<0.05）。無EGFR-TKIs作用時(shí)，PC-9/Cav-1細(xì)胞的穿膜數(shù)明顯多于PC-9/pcDNA3.1細(xì)胞，差

34、異均具有顯著性（P<0.05）。在EGFR-TKIs作用時(shí)，無論吉非替尼還是厄洛替尼，EGFR-TKIs對(duì)PC-9/Cav-1細(xì)胞侵襲能力的抑制效應(yīng)明顯弱于PC-9/pcDNA3.1細(xì)胞，差異均具有顯著性（P<0.05）。結(jié)果證實(shí)：過表達(dá)Cav-1可以增強(qiáng)PC-9細(xì)胞的生物學(xué)行為，減弱EGFR-TKIs對(duì)其抑制的效應(yīng)。
　　4.過表達(dá)Cav-1通過調(diào)控EGFR的活化降低PC-9細(xì)胞對(duì)EGFR-TKIs的敏感性
　　無EGFR

35、-TKIs作用時(shí)， PC-9/Cav-1細(xì)胞中p-EGFR、p-Akt、p-Erk的相對(duì)水平明顯高于PC-9/pcDNA3.1細(xì)胞，差異均有顯著性（P<0.05）。在有EGFR-TKIs作用時(shí)，無論吉非替尼還是厄洛替尼， EGFR-TKIs對(duì)PC-9/Cav-1細(xì)胞中p-EGFR、p-Akt、p-Erk表達(dá)水平的抑制效應(yīng)明顯弱于PC-9/pcDNA3.1細(xì)胞，差異均有顯著性（P<0.05）。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)Cav-1和EGFR可以直接

36、結(jié)合。激光共聚焦顯微鏡下觀察到細(xì)胞膜和細(xì)胞漿處紅色區(qū)域代表Cav-1表達(dá)，綠色區(qū)域代表EGFR表達(dá)，將兩者merge后的黃色代表Cav-1和EGFR共定位。結(jié)果證實(shí)：過表達(dá)Cav-1促進(jìn)PC-9細(xì)胞中MAPK和PI3K信號(hào)通路活化蛋白的表達(dá)，減弱EGFR-TKIs敏感性。
　　5.過表達(dá)Cav-1促進(jìn)裸鼠腫瘤組織的生長(zhǎng)
　　PC-9/Cav-1組裸鼠腫瘤體積明顯大于PC-9/pcDNA3.1組，差異均有顯著性（P<0.05）

37、；PC-9/Cav-1組裸鼠腫瘤重量明顯重于PC-9/pcDNA3.1組，差異均有顯著性（P<0.05）。
　　6.過表達(dá)Cav-1降低肺腺癌腫瘤組織對(duì)吉非替尼的敏感性
　　在吉非替尼灌胃2周后，PC-9/Cav-1組的裸鼠腫瘤體積呈緩慢增長(zhǎng)的趨勢(shì)，而PC-9/pcDNA3.1組的裸鼠腫瘤體積呈穩(wěn)定不變或緩慢縮小的趨勢(shì)，差異均有顯著性（P<0.05）。PC-9/Cav-1組的抑瘤率明顯小于PC-9/pcDNA3.1組，差異均

38、有顯著性（P<0.05）。Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Cav-1表達(dá)對(duì)瘤組織中MAPK和PI3K信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果同體外實(shí)驗(yàn)一致。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示：PC-9/Cav-1組中Cav-1和Ki-67的表達(dá)水平明顯高于PC-9/pcDNA3.1組；無吉非替尼作用時(shí)，Cav-1的表達(dá)水平與Ki-67存在正相關(guān)；有吉非替尼作用時(shí)，Ki-67的表達(dá)水平明顯下降。
　　結(jié)論：
　　1.Cav-1表達(dá)水平與肺腺癌EGFR-