農(nóng)桿菌介導(dǎo)的紅曲菌M-7轉(zhuǎn)化庫中部分突變子的特性研究.pdf

1、本研究以農(nóng)桿菌介導(dǎo)的紅曲菌轉(zhuǎn)化庫中的8132株轉(zhuǎn)化子為材料，通過菌落形態(tài)觀察結(jié)合顯微特征分析，篩選獲得一批形態(tài)特征變化顯著的轉(zhuǎn)化子，并將其分為七類。在此基礎(chǔ)上，對轉(zhuǎn)化子的主要代謝產(chǎn)物進(jìn)行了分析，為從基因水平上闡述紅曲菌代謝產(chǎn)物的合成調(diào)控機(jī)理提供了材料。主要研究結(jié)果如下。 1.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的紅曲菌T-DNA插入突變庫的擴(kuò)建 參照實(shí)驗(yàn)室以前建立的農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化紅色紅曲菌(Monascusruber)M-7的條件：出發(fā)菌株M-

2、7在麥芽汁培養(yǎng)基上30℃培養(yǎng)20d，紅曲菌孢子濃度為105個/mL，農(nóng)桿菌的濃度OD600為0.5，誘導(dǎo)劑AS濃度為80mmol/L，農(nóng)桿菌與紅曲孢子混合液于30℃共培養(yǎng)3d，將轉(zhuǎn)化庫從5132轉(zhuǎn)化子擴(kuò)增至8132個轉(zhuǎn)化子。 2.轉(zhuǎn)化子篩選及形態(tài)觀察 將8132個轉(zhuǎn)化子分別接種在PDA培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)15d。通過菌落形態(tài)觀察，獲得230株在菌落顏色、生長速度和氣生菌絲等方面都與出發(fā)菌株M-7有明顯差異的轉(zhuǎn)化子，并將其

3、分為七類：(1)菌落直較徑大，菌落呈年輪狀分布；(2)菌落直徑較大，菌落顏色較淺，氣生菌絲呈從卷毛狀；(3)菌落直徑較大，菌落顏色較淺，氣生菌絲呈流蘇狀；(4)菌落直徑較大，菌落顏色較深，氣生菌絲呈從卷毛狀；(5)菌落直徑較小，菌落平坦，氣生菌絲呈從卷毛狀；(6)菌落直徑較小，菌落中部隆起，氣生菌絲較短；(7)菌落直徑中等，菌落有扇形分化。從每一類中再挑選一些具有代表性的菌株進(jìn)行顯微形態(tài)觀察，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)化子在分生孢子形狀、菌絲表面附著

4、物、閉囊殼的數(shù)量和形態(tài)上也發(fā)生較大變化。 3.部分轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定及穩(wěn)定性研究 從上述230株將轉(zhuǎn)化子中挑選35株接種于不含潮霉素的PDA培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)7d，連續(xù)轉(zhuǎn)接5代后，再轉(zhuǎn)接到含有50μg/mL，潮霉素的PDA平板上，以出發(fā)菌株M-7作為對照，觀察菌落在抗性培養(yǎng)基上的生長狀況并計(jì)數(shù)。從35株轉(zhuǎn)化子中挑選14株代表菌株，提取基因組并進(jìn)行PCR鑒定(根據(jù)T-DNA上的gus基因設(shè)計(jì)引物)。結(jié)果顯示上述14株轉(zhuǎn)化

5、子經(jīng)過5輪培養(yǎng)后，仍能在含50μg/mL潮霉素的PDA平板上生長，抗性穩(wěn)定性達(dá)88.57％，并且14株轉(zhuǎn)化子的基因組中均有T-DNA插入。 4.部分轉(zhuǎn)化子蛋白酶和淀粉酶活的分析 采用DNS法、Folin法等方法測定了上述14株轉(zhuǎn)化子固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物--紅曲的淀粉酶活、蛋白酶活，并結(jié)合淀粉聚丙烯酰胺凝膠電泳(Starch-PAGE)的方法比較不同轉(zhuǎn)化子淀粉酶組份和活性差異。 結(jié)果如下：有13株轉(zhuǎn)化子紅曲的淀粉酶活高于M

6、-7的淀粉酶活160.45U/g，其中1067＃約為M-7的20倍，達(dá)3227.10U/g；大部分的供試菌株蛋白酶均高于M-7，其中878＃的酸性蛋白酶活最高，達(dá)1543U/g，約為M-7的2倍；1067＃的中性蛋白酶活最高，達(dá)3211U/g，約為M-7的4倍；2225＃的堿性蛋白酶活最高，達(dá)1773U/g，約為M-7的4倍。采用Starch-PAGE能夠有效的檢測淀粉酶活性組分，結(jié)果顯示活性組分越多，淀粉酶活力越高。 5.部分

7、轉(zhuǎn)化子次生代謝產(chǎn)物的分析 采用UV-VIS、TLC、HPLC、ELISA等方法測定了14株轉(zhuǎn)化子紅曲的色價、MonacolinK、γ-氨基丁酸和桔霉素的含量。結(jié)果表明，與出發(fā)菌株相比，突變株產(chǎn)次級代謝產(chǎn)物的能力都發(fā)生了不同程度的變化。14株轉(zhuǎn)化子的紅曲色價值均低于出發(fā)菌株M-7的色價4350u/g，其中806＃和2553＃的色價分別為180u/g和328u/g，不到M-7的1/10；10株突菌株紅曲的MonacolinK含量高于